| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-10页 |
| 第一章 绪论 | 第10-26页 |
| ·概述 | 第10页 |
| ·木聚糖的结构和木聚糖降解酶系统 | 第10-11页 |
| ·木聚糖酶研究进展 | 第11-24页 |
| ·木聚糖酶的类别 | 第11-12页 |
| ·木聚糖酶的多样性 | 第12-13页 |
| ·木聚糖酶的酶学性质 | 第13页 |
| ·木聚糖酶的诱导和抑制机理 | 第13-16页 |
| ·木聚糖酶的分子结构 | 第16-18页 |
| ·木聚糖酶的分子催化机理 | 第18页 |
| ·木聚糖酶基因的克隆和表达 | 第18-21页 |
| ·木聚糖酶分子的进化 | 第21页 |
| ·木聚糖酶基因的改造 | 第21-22页 |
| ·木聚糖酶的应用 | 第22-24页 |
| ·研究的内容、目的和意义 | 第24-26页 |
| 第二章 木聚糖酶基因xynⅡ的克隆和序列分析 | 第26-40页 |
| ·引言 | 第26页 |
| ·材料与方法 | 第26-33页 |
| ·菌株与质粒 | 第26-27页 |
| ·化学试剂及试剂盒 | 第27页 |
| ·溶液配制 | 第27-28页 |
| ·主要仪器 | 第28页 |
| ·PCR引物的设计与合成 | 第28-29页 |
| ·培养基 | 第29页 |
| ·XynⅡ的N端氨基酸序列测定 | 第29页 |
| ·宇佐美曲霉总RNA提取 | 第29页 |
| ·宇佐美曲霉总DNA的抽提 | 第29页 |
| ·3'RACE法扩增XynⅡ cDNA部分序列 | 第29-30页 |
| ·5'RACE法扩增XynⅡ cDNA部分序列 | 第30页 |
| ·PCR扩增XynⅡ DNA序列 | 第30页 |
| ·DNA电泳回收 | 第30-31页 |
| ·PCR产物的TA克隆 | 第31页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第32页 |
| ·重组子的筛选 | 第32页 |
| ·序列测定及序列分析 | 第32-33页 |
| ·结果与分析 | 第33-38页 |
| ·宇佐美曲霉总RNA提取 | 第33页 |
| ·XynⅡ cDNA部分序列的3'RACE法扩增、克隆和测定 | 第33页 |
| ·XynⅡ cDNA部分序列的5'RACE法扩增、克隆和测定 | 第33-34页 |
| ·XynⅡ cDNA序列分析 | 第34-35页 |
| ·XynⅡ DNA序列的PCR扩增、克隆和测定 | 第35-36页 |
| ·XynⅡ DNA序列分析 | 第36页 |
| ·宇佐美曲霉木聚糖酶XynⅡ与其它木聚糖酶一级结构的同源性比较 | 第36-37页 |
| ·木聚糖酶XynⅡ的系统进化树分析 | 第37-38页 |
| ·XynⅡ二级结构分析及三维结构建模 | 第38页 |
| ·本章小结 | 第38-40页 |
| 第三章 木聚糖酶基因xynⅡ在大肠杆菌中的表达 | 第40-56页 |
| ·引言 | 第40页 |
| ·材料与方法 | 第40-46页 |
| ·菌株与质粒 | 第40页 |
| ·生化试剂 | 第40-41页 |
| ·溶液配制 | 第41-43页 |
| ·培养基及培养条件 | 第43页 |
| ·PCR引物的设计与合成 | 第43页 |
| ·目的基因的扩增及大肠杆菌重组表达载体的构建 | 第43页 |
| ·诱导产酶及粗酶提取方法 | 第43页 |
| ·重组大肠杆菌表达产物的分析 | 第43-45页 |
| ·大肠杆菌重组木聚糖酶的纯化 | 第45页 |
| ·酶学性质的测定 | 第45-46页 |
| ·结果与分析 | 第46-54页 |
| ·大肠杆菌表达载体的构建 | 第46-47页 |
| ·不同表达载体在大肠杆菌中表达木聚糖酶 | 第47-49页 |
| ·稀有密码子加富对重组木聚糖酶表达的影响 | 第49-50页 |
| ·木聚糖酶在大肠杆菌中表达条件的优化 | 第50-53页 |
| ·重组表达木聚糖酶的性质 | 第53-54页 |
| ·本章小结 | 第54-56页 |
| 第四章 木聚糖酶基因xynⅡ在毕赤酵母中的分泌表达 | 第56-76页 |
| ·引言 | 第56-57页 |
| ·材料与方法 | 第57-63页 |
| ·酶及主要试剂 | 第57页 |
| ·培养基及主要化学试剂的配制 | 第57-59页 |
| ·主要仪器 | 第59页 |
| ·菌株与质粒 | 第59页 |
| ·目的基因的扩增及重组表达载体pPIC9K-xynⅡ的构建 | 第59-60页 |
| ·重组表达质粒pPIC9K-xynⅡ的线性化及纯化 | 第60页 |
| ·毕赤酵母GS115及KM71电转化感受态细胞的制备 | 第60页 |
| ·酵母细胞的转化 | 第60-61页 |
| ·采用G418浓度梯度培养基筛选毕赤酵母高拷贝转化子 | 第61页 |
| ·毕赤酵母甲醇利用表型的鉴定 | 第61页 |
| ·目的基因在毕赤酵母中的表达 | 第61页 |
| ·重组毕赤酵母表达产物的分析 | 第61-62页 |
| ·酵母分泌情况的确定 | 第62页 |
| ·毕赤酵母总DNA提取 | 第62页 |
| ·重组毕赤酵母的稳定性检测 | 第62页 |
| ·重组木聚糖酶的纯化 | 第62-63页 |
| ·重组木聚糖酶酶学性质的测定 | 第63页 |
| ·结果与讨论 | 第63-74页 |
| ·重组表达载体pPIC9K-xynⅡ的构建 | 第63-65页 |
| ·重组表达质粒pPIC9K-xynⅡ的大量提取及线性化 | 第65页 |
| ·酵母的电击转化与筛选 | 第65-66页 |
| ·重组毕赤酵母的诱导产酶 | 第66页 |
| ·重组毕赤酵母的遗传稳定性 | 第66页 |
| ·毕赤酵母工程菌发酵条件的优化 | 第66-70页 |
| ·毕赤酵母分泌情况的确定 | 第70页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第70页 |
| ·重组木聚糖酶的纯化 | 第70-71页 |
| ·重组表达木聚糖酶的性质 | 第71-73页 |
| ·酶学性质的比较与分析 | 第73-74页 |
| ·本章小结 | 第74-76页 |
| 第五章 木聚糖酶XynⅡ催化残基的研究及最适pH值的定向诱变 | 第76-87页 |
| ·引言 | 第76页 |
| ·材料与方法 | 第76-79页 |
| ·酶、培养基与主要试剂 | 第76-77页 |
| ·菌株与质粒 | 第77页 |
| ·催化残基及相关位点的确定 | 第77页 |
| ·定向诱变方法 | 第77-78页 |
| ·重组表达载体pET-28a-xynⅡB~*与pPIC9K-xynⅡB~*的构建 | 第78-79页 |
| ·突变酶基因xynⅡB~*在大肠杆菌中的表达 | 第79页 |
| ·突变酶基因xynⅡB~*在毕赤酵母中的表达 | 第79页 |
| ·突变木聚糖酶的纯化 | 第79页 |
| ·突变木聚糖酶酶学性质的测定 | 第79页 |
| ·结果与分析 | 第79-86页 |
| ·催化残基及相关位点的确定 | 第79-81页 |
| ·催化残基及相关位点的定向诱变 | 第81-82页 |
| ·重组表达质粒pET-28a-xynⅡB~*与pPIC9K-xynⅡB~*的构建 | 第82-83页 |
| ·重组突变木聚糖酶的表达及纯化 | 第83-84页 |
| ·酶学性质的比较与分析 | 第84-86页 |
| ·本章小结 | 第86-87页 |
| 第六章 木聚糖酶XynⅡ热稳定性的定向诱变研究 | 第87-96页 |
| ·引言 | 第87页 |
| ·材料与方法 | 第87-89页 |
| ·酶、培养基与主要试剂 | 第87页 |
| ·菌株与质粒 | 第87页 |
| ·影响热稳定性的残基位点的确定 | 第87-88页 |
| ·定向诱变方法 | 第88-89页 |
| ·重组表达载体pPIC9K-xynⅡC~*的构建 | 第89页 |
| ·突变酶基因xynⅡC~*在毕赤酵母中的表达 | 第89页 |
| ·突变木聚糖酶的纯化 | 第89页 |
| ·突变酶酶学性质的测定 | 第89页 |
| ·结果与分析 | 第89-95页 |
| ·影响热稳定性的残基位点的确定 | 第89-90页 |
| ·Arg引入"Ser/Thr"平面的定向诱变 | 第90-92页 |
| ·重组表达质粒pPIC9K-xynⅡC~*的构建 | 第92-93页 |
| ·突变酶的表达及纯化 | 第93页 |
| ·突变酶酶学性质的比较与分析 | 第93-95页 |
| ·本章小结 | 第95-96页 |
| 论文结论与展望 | 第96-98页 |
| 论文创新点 | 第98-99页 |
| 致谢 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-115页 |
| 附录 | 第115-124页 |
| 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第124页 |
