| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-10页 |
| 引言 | 第10-32页 |
| 1 流感病毒毒力因子的研究 | 第11-19页 |
| ·通过抗原变异逃避宿主的保护性免疫 | 第11-13页 |
| ·HA 是A 型流感病毒毒力的主要决定因素 | 第13-16页 |
| ·NA 对流感病毒的毒力有一定的作用 | 第16-18页 |
| ·内部基因产物与流感病毒的毒力 | 第18-19页 |
| 2 流感病毒反向遗传操作技术研究进展 | 第19-32页 |
| ·流感病毒及其基因组特征 | 第20-21页 |
| ·流感病毒的复制 | 第21-24页 |
| ·吸附、穿膜和脱壳 | 第22-23页 |
| ·基因组的转录与复制 | 第23页 |
| ·病毒蛋白的合成 | 第23页 |
| ·病毒粒子的装配 | 第23页 |
| ·病毒的出芽和释放 | 第23-24页 |
| ·病毒反向遗传操作技术体系的建立 | 第24-26页 |
| ·从克隆的 cDNA 产生负义 RNA 病毒的概况 | 第26页 |
| ·流感病毒反向遗传操作技术的历史与发展 | 第26-32页 |
| ·用于流感病毒复制与转录研究的系统 | 第26-27页 |
| ·以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统 | 第27-29页 |
| ·能对流感病毒任何片段进行突变的一个特殊系统 | 第29页 |
| ·完全以克隆的 cDNA 为基础的反向遗传操作系统 | 第29-32页 |
| 实验一 流感病毒八质粒冷适应拯救系统转录/表达质粒的构建 | 第32-44页 |
| 1 材料 | 第33-35页 |
| ·病毒株 | 第33页 |
| ·主要试剂 | 第33页 |
| ·主要仪器 | 第33-34页 |
| ·分子生物学分析软件 | 第34页 |
| ·用于RNA 操作试剂和器材的DEPC 处理 | 第34页 |
| ·双向转录/表达载体 | 第34页 |
| ·冷适应株六个骨架片段 | 第34-35页 |
| 2 方法 | 第35-40页 |
| ·基因组RNA 的提取 | 第35页 |
| ·反转录 | 第35页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第35页 |
| ·转录/表达质粒构建:克隆流感病毒各片段 cDNA 到 pAD3000 的策略 | 第35-36页 |
| ·转录/表达质粒 pAD-HA 和 pAD-NA 的构建 | 第36-39页 |
| ·RT-PCR 扩增流行株HA、NA 基因 | 第36-37页 |
| ·连接 | 第37页 |
| ·转化 | 第37页 |
| ·菌落PCR 鉴定阳性克隆 | 第37页 |
| ·测序鉴定HA、NA 片段 | 第37页 |
| ·小提质粒 | 第37-38页 |
| ·酶切回收目的片段 | 第38页 |
| ·转录/表达载体 pAD3000 的酶切回收 | 第38页 |
| ·连接 | 第38页 |
| ·转化 | 第38页 |
| ·菌落PCR 鉴定阳性克隆 | 第38-39页 |
| ·测序鉴定 | 第39页 |
| ·转录/表达质粒 pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-NP、pAD-M、pAD-NS 的构建 | 第39-40页 |
| ·转化 | 第39页 |
| ·小提质粒 | 第39页 |
| ·酶切回收目的片段 | 第39页 |
| ·连接 | 第39-40页 |
| ·转化 | 第40页 |
| ·菌落PCR 鉴定阳性克隆 | 第40页 |
| ·测序鉴定 | 第40页 |
| 3 结果 | 第40-43页 |
| ·HA、NA 基因扩增结果 | 第40-41页 |
| ·冷适应骨架基因片段 | 第41页 |
| ·转录/表达质粒 pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-HA、pAD-NP、pAD-NA、pAD-M、pAD-NS 的构建结果 | 第41-43页 |
| 4 讨论 | 第43页 |
| 5 小结 | 第43-44页 |
| 实验二 通过反向遗传操作技术以八质粒拯救系统产生H1N1 亚型流感病毒冷适应株 | 第44-56页 |
| 1 材料 | 第45-46页 |
| ·细胞、鸡胚 | 第45页 |
| ·主要试剂 | 第45页 |
| ·转录/表达载体的工作原理 | 第45-46页 |
| 2 方法 | 第46-48页 |
| ·建立流感病毒反向遗传操作技术路线 | 第46页 |
| ·质粒提取 | 第46-47页 |
| ·转染前准备 | 第47页 |
| ·转染 | 第47页 |
| ·重组病毒验证 | 第47-48页 |
| ·RT-PCR 验证 | 第47页 |
| ·MDCK 细胞感染 | 第47页 |
| ·免疫荧光鉴定重组病毒 | 第47-48页 |
| ·电镜形态观察 | 第48页 |
| 3 结果 | 第48-51页 |
| ·转染前细胞状态 | 第48页 |
| ·重组病毒血凝试验结果 | 第48-49页 |
| ·重组病毒RT-PCR 验证结果 | 第49页 |
| ·MDCK 细胞感染结果 | 第49-50页 |
| ·重组病毒免疫荧光结果 | 第50页 |
| ·重组病毒电镜形态观察结果 | 第50-51页 |
| 4 讨论 | 第51-55页 |
| ·关于八质粒系统的工作原理 | 第51-52页 |
| ·关于 H1N1 亚型重组病毒和野生型 A/New Caldonia/20/99 的一些特性比较 | 第52-53页 |
| ·提高拯救效率应注意的问题 | 第53-55页 |
| 5 小结 | 第55-56页 |
| 结论 | 第56-57页 |
| 致谢 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-69页 |
| 作者简介 | 第69页 |
