| 目录 | 第1-7页 |
| 中文摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略词表 | 第10-12页 |
| 前言 | 第12-15页 |
| 第一部分 人胰腺癌细胞系PANC-1和CAPAN-1的生物学特性 | 第15-26页 |
| 1 实验材料 | 第15-17页 |
| ·人胰腺癌细胞系 | 第15页 |
| ·裸鼠 | 第15页 |
| ·主要化学试剂 | 第15-16页 |
| ·主要溶液配方 | 第16页 |
| ·主要仪器设备 | 第16-17页 |
| ·主要实验耗材 | 第17页 |
| 2 实验方法 | 第17-22页 |
| ·细胞培养 | 第17-18页 |
| ·细胞的生长条件 | 第17页 |
| ·细胞复苏 | 第17-18页 |
| ·细胞传代 | 第18页 |
| ·细胞冻存 | 第18页 |
| ·细胞计数 | 第18页 |
| ·PANC-1和CAPAN-1细胞生长曲线测定(MTT法) | 第18-19页 |
| ·实验原理 | 第19页 |
| ·实验步骤 | 第19页 |
| ·裸鼠体内成瘤实验 | 第19-20页 |
| ·PANC-1和CAPAN-1胰腺癌细胞系药物敏感性实验 | 第20-21页 |
| ·嘌呤霉素(Puromycin)最佳筛选浓度测定 | 第20-21页 |
| ·G418最佳筛选浓度测定 | 第21页 |
| ·PANC-1和CAPAN-1对GEM的反应测定 | 第21-22页 |
| 3 实验结果 | 第22-25页 |
| ·PANC-1和CAPAN-1生长曲线 | 第22-23页 |
| ·裸鼠体内成瘤实验结果 | 第23页 |
| ·PANC-1和CAPAN-1各药物最佳筛选浓度 | 第23-24页 |
| ·PANC-1和CAPAN-1对GEM的反应检测 | 第24-25页 |
| 4 小结 | 第25-26页 |
| 第二部分 Tet-off稳定表达细胞系的建立 | 第26-46页 |
| 1 实验材料 | 第27-31页 |
| ·PANC-1和CAPAN-1人胰腺癌细胞系 | 第27页 |
| ·菌株 | 第27页 |
| ·质粒 | 第27-28页 |
| ·工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker | 第28页 |
| ·主要化学试剂 | 第28页 |
| ·主要实验耗材 | 第28页 |
| ·主要仪器及设备 | 第28-29页 |
| ·E.coli用培养基的配制 | 第29页 |
| ·SOC培养基配制 | 第29页 |
| ·主要溶液配方 | 第29-31页 |
| 2 实验方法 | 第31-40页 |
| ·感受态大肠杆菌DH10B的制备 | 第31-32页 |
| ·CAG-tTA克隆构建 | 第32-36页 |
| ·转录激活因子tTA的PCR扩增 | 第32-33页 |
| ·连接载体CAG-Puro的准备 | 第33-34页 |
| ·CAG-tTA重组质粒的筛选和鉴定 | 第34-36页 |
| ·CAG-tTA质粒DNA的小量提取 | 第36-37页 |
| ·CAG-tTA质粒DNA的大量提取 | 第37-38页 |
| ·CAG-tTA质粒PANC-1和CAPAN-1的稳定转染 | 第38-39页 |
| ·荧光素酶(Luciferase)报告基因检测 | 第39-40页 |
| 3 实验结果 | 第40-45页 |
| ·CAG-tTA质粒构建 | 第40-42页 |
| ·tTA PCR产物纯化结果 | 第40页 |
| ·连接载体CAG-Puro获得 | 第40页 |
| ·CAG-tTA重组质粒的筛选和鉴定 | 第40-42页 |
| ·PANC-1和CAPAN-1的Tet-Off稳定表达细胞系的建立 | 第42-45页 |
| ·转染外源基因CAG-tTA阳性克隆的筛选 | 第42页 |
| ·Luciferase报告基因检测 | 第42-44页 |
| ·高表达且可调控Tet-off稳定表达细胞系的比较鉴定 | 第44-45页 |
| 4 小结 | 第45-46页 |
| 第三部分 全基因组随机基因突变文库的建立 | 第46-58页 |
| 1 实验材料 | 第48-50页 |
| ·细胞系 | 第48页 |
| ·质粒 | 第48-49页 |
| ·主要实验耗材 | 第49页 |
| ·主要仪器及设备 | 第49页 |
| ·主要溶液配方 | 第49页 |
| ·TB培养基的配制 | 第49-50页 |
| 2 实验方法 | 第50-54页 |
| ·基因搜寻载体的构建 | 第50-53页 |
| ·基因搜寻载体核心元件的构建 | 第50-52页 |
| ·piggyBac空载体的获得 | 第52页 |
| ·基因搜寻前载体的构建 | 第52页 |
| ·基因搜寻载体的进一步完善 | 第52-53页 |
| ·TNO-PB和mPB电穿孔共转染PANC-1-PC68 | 第53-54页 |
| 3 实验结果 | 第54-56页 |
| ·基因搜寻载体的构建 | 第54-56页 |
| ·全基因组随机插入突变文库的建立 | 第56页 |
| 4 小结 | 第56-58页 |
| 第四部分 GEM耐药表型的筛选 | 第58-62页 |
| 1 实验材料 | 第58-59页 |
| ·细胞系 | 第58页 |
| ·主要实验试剂 | 第58-59页 |
| ·主要仪器设备 | 第59页 |
| 2 实验方法 | 第59-60页 |
| 3 实验结果 | 第60页 |
| 4 小结 | 第60-62页 |
| 第五部分 GEM耐药表型的基因克隆和功能鉴定分析 | 第62-69页 |
| 1 实验材料 | 第64页 |
| ·基因组DNA | 第64页 |
| ·工具酶和酶切缓冲液和DNA Marker | 第64页 |
| ·主要溶液配方 | 第64页 |
| 2 实验方法 | 第64-67页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第64-65页 |
| ·基因克隆 | 第65-67页 |
| ·自连法分子克隆(Self-Ligation Clonging) | 第65页 |
| ·Splinkerette-PCR克隆 | 第65-67页 |
| 3 实验结果 | 第67-68页 |
| 4 小结 | 第68-69页 |
| 第六部分 诱导干细胞特性的胰腺癌细胞与GEM化疗耐药关系的研究 | 第69-79页 |
| 1 实验材料 | 第70-73页 |
| ·细胞系 | 第70页 |
| ·质粒 | 第70-71页 |
| ·主要实验试剂 | 第71-72页 |
| ·细胞培养试剂 | 第71-72页 |
| ·鉴定试剂 | 第72页 |
| ·主要溶液配方 | 第72-73页 |
| 2 实验方法 | 第73-76页 |
| ·人胰腺癌细胞株CAPAN-1多能干细胞(iPS)的诱导 | 第73-75页 |
| ·PB-TET-MKOS及mPB的共转染 | 第73-74页 |
| ·人胰腺癌细胞株CAPAN-1多能干细胞(iPS)的鉴定 | 第74页 |
| ·滋养层细胞(SNLP)及人工诱导的干细胞(iPS)的培养 | 第74-75页 |
| ·CAPAN-1-2D2/iPS样细胞与GEM化疗耐药关系的探索 | 第75-76页 |
| 3 实验结果 | 第76-78页 |
| ·诱导CAPAN-1-2D2/iPS样细胞形成 | 第76页 |
| ·诱导CAPAN-1-2D2/iPS样细胞的鉴定 | 第76-78页 |
| 4 小结 | 第78-79页 |
| 统计学分析 | 第79页 |
| 讨论 | 第79-81页 |
| 参考文献 | 第81-87页 |
| 综述一 | 第87-93页 |
| 综述二 | 第93-100页 |
| 参考文献 | 第97-100页 |
| 在读期间论文发表及参加会议情况 | 第100-102页 |
| 致谢 | 第102页 |
