| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-41页 |
| ·蛋白类药物 | 第15页 |
| ·蛋白类药物的研究现状 | 第15页 |
| ·蛋白药物存在的问题 | 第15页 |
| ·蛋白质的聚乙二醇修饰 | 第15-22页 |
| ·聚乙二醇(PEG)简介 | 第16-17页 |
| ·PEG化化学 | 第17-22页 |
| ·第一代PEG化化学 | 第18页 |
| ·第二代PEG化化学 | 第18-22页 |
| ·PEG修饰技术的主要发展趋势和现状 | 第22-24页 |
| ·pH控制的氨基定点修饰 | 第23页 |
| ·羰基定点修饰 | 第23页 |
| ·基于氨基保护的定点修饰 | 第23页 |
| ·二硫键定点修饰 | 第23-24页 |
| ·非极性氨基酸定点修饰 | 第24页 |
| ·其他定点修饰方法 | 第24页 |
| ·修饰后蛋白性质的改变 | 第24-25页 |
| ·影响PEG修饰反应的因素 | 第25-29页 |
| ·蛋白质的性质 | 第26页 |
| ·修饰剂的选择 | 第26-27页 |
| ·反应条件的选择 | 第27-29页 |
| ·反应介质 | 第27-28页 |
| ·修饰反应的pH值和离子强度 | 第28页 |
| ·PEG与蛋白质的摩尔比 | 第28页 |
| ·蛋白浓度 | 第28页 |
| ·反应时间 | 第28页 |
| ·反应温度 | 第28-29页 |
| ·聚乙二醇修饰产物的分离纯化 | 第29-32页 |
| ·分子排阻层析 | 第29-30页 |
| ·离子交换层析 | 第30-31页 |
| ·疏水相互作用层析 | 第31页 |
| ·亲和层析 | 第31-32页 |
| ·修饰蛋白的分析与表征 | 第32-33页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第32页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第32页 |
| ·分子量的测定和分析 | 第32-33页 |
| ·PEG化位点的分析 | 第33页 |
| ·PEG化位点的鉴定 | 第33页 |
| ·位点异构体的分离方法 | 第33页 |
| ·PEG修饰蛋白质的应用及局限性 | 第33-35页 |
| ·PEG修饰蛋白的应用 | 第34-35页 |
| ·PEG修饰蛋白的局限性及发展方向 | 第35页 |
| ·促红细胞生成素的研究进展 | 第35-39页 |
| ·促红细胞生成素简介 | 第35-36页 |
| ·Epo的结构 | 第36-37页 |
| ·Epo在临床上的应用 | 第37-39页 |
| ·慢性肾病 | 第37页 |
| ·获得性免疫缺陷综合症(AIDS) | 第37-38页 |
| ·肿瘤 | 第38页 |
| ·丙型肝炎(HCV)感染 | 第38页 |
| ·中枢神经系统疾病 | 第38-39页 |
| ·主要实验思路及技术路线 | 第39-41页 |
| 第二章 促红细胞生成素的聚乙二醇修饰 | 第41-59页 |
| ·材料和仪器 | 第41-44页 |
| ·实验材料 | 第41-42页 |
| ·仪器设备 | 第42页 |
| ·主要试剂 | 第42-44页 |
| ·培养基 | 第42-43页 |
| ·磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制 | 第43页 |
| ·磷酸缓冲液的配制 | 第43-44页 |
| ·氰基硼氢化钠溶液 | 第44页 |
| ·甘氨酸溶液 | 第44页 |
| ·实验方法 | 第44-50页 |
| ·工程菌的培养发酵 | 第44页 |
| ·摇瓶种子培养 | 第44页 |
| ·摇瓶发酵培养 | 第44页 |
| ·发酵罐培养 | 第44页 |
| ·包涵体的制备 | 第44-45页 |
| ·rh-ngEpo蛋白纯品的制备 | 第45页 |
| ·rh-ngEpo包涵体的变性与复性 | 第45页 |
| ·rh-ngEpo的纯化 | 第45页 |
| ·20kDa mPEG-ALD修饰rh-ngEpo反应条件的优化 | 第45-47页 |
| ·稳定剂的影响 | 第45-46页 |
| ·pH值的影响 | 第46页 |
| ·修饰剂与蛋白质配比的影响 | 第46页 |
| ·蛋白浓度的影响 | 第46页 |
| ·还原剂比例的影响 | 第46-47页 |
| ·反应时间的影响 | 第47页 |
| ·检测方法 | 第47-50页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第47页 |
| ·还原型SDS-PAGE | 第47-49页 |
| ·高效凝胶过滤色谱(HPSEC)检测 | 第49页 |
| ·反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测 | 第49-50页 |
| ·修饰转化率的计算 | 第50页 |
| ·结果和讨论 | 第50-57页 |
| ·重组人促红细胞生成素的诱导表达 | 第50-51页 |
| ·rh-ngEpo的复性与纯化 | 第51-52页 |
| ·20kDa mPEG-ALD修饰rh-ngEpo反应条件的优化结果 | 第52-57页 |
| ·稳定剂 | 第52-53页 |
| ·pH值 | 第53页 |
| ·修饰剂/蛋白的配比 | 第53-54页 |
| ·蛋白浓度 | 第54-55页 |
| ·还原剂比例 | 第55页 |
| ·反应时间 | 第55-56页 |
| ·30kDa mPEG-ALD的修饰 | 第56-57页 |
| ·本章小结 | 第57-59页 |
| 第三章 聚乙二醇化促红细胞生成素的分离纯化 | 第59-67页 |
| ·材料和仪器 | 第59-60页 |
| ·实验材料 | 第59-60页 |
| ·仪器设备 | 第60页 |
| ·主要试剂 | 第60页 |
| ·实验方法 | 第60-62页 |
| ·修饰产物的分离纯化 | 第60-61页 |
| ·20kDa mPEG-ALD修饰后的分离纯化 | 第60-61页 |
| ·30kDa mPEG-ALD修饰后的分离纯化 | 第61页 |
| ·检测方法 | 第61-62页 |
| ·SDS-PAGE | 第61页 |
| ·高效凝胶过滤色谱检测 | 第61页 |
| ·反相高效液相色谱检测 | 第61-62页 |
| ·结果与讨论 | 第62-65页 |
| ·20kDa mPEG-ALD修饰后的分离纯化 | 第62-63页 |
| ·30kDa mPEG-ALD修饰后的分离纯化 | 第63-64页 |
| ·单修饰产物的HPSEC和RP-HPLC分析 | 第64-65页 |
| ·本章小结 | 第65-67页 |
| 第四章 聚乙二醇化促红细胞生成素的性质考察 | 第67-79页 |
| ·材料和仪器 | 第67-68页 |
| ·实验材料 | 第67页 |
| ·仪器设备 | 第67-68页 |
| ·实验方法 | 第68-71页 |
| ·MALDI-TOF MS测定分子量 | 第68页 |
| ·二级结构的测定 | 第68页 |
| ·分子构象的测定 | 第68-69页 |
| ·荧光光谱法及其检测分析原理 | 第69页 |
| ·操作方法 | 第69页 |
| ·修饰位点的确定 | 第69页 |
| ·热稳定性实验 | 第69页 |
| ·体外活性的测定(酶联免疫法,ELISA) | 第69-70页 |
| ·循环半衰期的测定 | 第70页 |
| ·检测方法 | 第70-71页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第70页 |
| ·高效凝胶过滤色谱检测 | 第70页 |
| ·反相高效液相色谱检测 | 第70-71页 |
| ·结果与讨论 | 第71-77页 |
| ·MALDI-TOF MS测定分子量 | 第71-72页 |
| ·圆二色谱和荧光图谱 | 第72-73页 |
| ·修饰位点分析 | 第73-75页 |
| ·热稳定性实验 | 第75页 |
| ·体外活性 | 第75-76页 |
| ·药代动力学的考察 | 第76-77页 |
| ·本章小结 | 第77-79页 |
| 第五章 结论与展望 | 第79-81页 |
| ·研究总结 | 第79-80页 |
| ·工作展望 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-89页 |
| 作者及导师简介 | 第89-91页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第91-93页 |
| 致谢 | 第93页 |