| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 绪论 | 第13-28页 |
| 1.1 引言 | 第13页 |
| 1.2 烟酰胺类辅酶的再生及其研究进展 | 第13-14页 |
| 1.3 辅酶再生的研究 | 第14-16页 |
| 1.3.1 酶法再生 | 第14-15页 |
| 1.3.2 全细胞再生 | 第15-16页 |
| 1.3.3 化学法 | 第16页 |
| 1.4 NADPH的研究进展 | 第16-19页 |
| 1.4.1 NADPH的结构 | 第16页 |
| 1.4.2 NADPH产生的两个主要途径 | 第16-17页 |
| 1.4.3 NADPH的稳定性 | 第17页 |
| 1.4.4 NADPH的反应 | 第17-18页 |
| 1.4.5 NADPH的作用 | 第18页 |
| 1.4.6 NAD(P)~+及NADPH的再生 | 第18-19页 |
| 1.5 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的研究进展 | 第19-22页 |
| 1.5.1 人体中的G6PDH | 第19-20页 |
| 1.5.2 植物中的G6PDH | 第20页 |
| 1.5.3 G6PDH的酶学特性 | 第20页 |
| 1.5.4 G6PDH多样性 | 第20-21页 |
| 1.5.5 G6PDH的应用 | 第21-22页 |
| 1.6 甾体C_(11)α羟基化的研究进展 | 第22-26页 |
| 1.6.1 甾体化合物C_(11)羟基化的化学引入法 | 第23-25页 |
| 1.6.2 生物催化转化甾体化合物C_(11)羟基化 | 第25-26页 |
| 1.7 本论文的研究思路及内容 | 第26-28页 |
| 1.7.1 研究背景 | 第26-27页 |
| 1.7.2 研究内容 | 第27-28页 |
| 第二章 重组质粒的构建及原生质体转化 | 第28-49页 |
| 2.1 引言 | 第28页 |
| 2.2 材料与方法 | 第28-29页 |
| 2.2.1 药品与试剂 | 第28页 |
| 2.2.2 实验仪器 | 第28页 |
| 2.2.3 菌种及质粒 | 第28-29页 |
| 2.2.4 相关试剂 | 第29页 |
| 2.2.5 培养基的配制 | 第29页 |
| 2.2.6 菌种活化 | 第29页 |
| 2.3 真菌表达载体的构建 | 第29-36页 |
| 2.3.1 米根霉RNA的提取 | 第29-30页 |
| 2.3.2 质粒的提取 | 第30-31页 |
| 2.3.3 黑根霉基因组的提取 | 第31页 |
| 2.3.4 感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| 2.3.5 引物设计 | 第32页 |
| 2.3.6 目的基因G6PDH的克隆 | 第32页 |
| 2.3.7 终止子TtrpC的克隆 | 第32-34页 |
| 2.3.8 启动子PgpdA的克隆 | 第34-35页 |
| 2.3.9 pCB1004-G6PDH的构建 | 第35-36页 |
| 2.4 黑根霉原生质体的制备及PEG介导的原生质体转化 | 第36-37页 |
| 2.4.1 潮霉素B对黑根霉的敏感性实验 | 第36页 |
| 2.4.2 黑根霉原生质体的制备 | 第36页 |
| 2.4.3 黑根霉原生质体的再生 | 第36-37页 |
| 2.4.4 PEG介导的原生质体转化 | 第37页 |
| 2.5 黑根霉工程菌的鉴定 | 第37-38页 |
| 2.5.1 PCR鉴定转化子 | 第37页 |
| 2.5.2 NADPH的测量 | 第37-38页 |
| 2.5.3 黑根霉基因工程菌发酵检测 | 第38页 |
| 2.6 结果与讨论 | 第38-48页 |
| 2.6.1 RNA的检测 | 第38页 |
| 2.6.2 G6PDH基因的分析检测 | 第38-39页 |
| 2.6.3 pCB1004-G6PDH质粒的构建与检测 | 第39-40页 |
| 2.6.4 潮霉素B对黑根霉的抑制浓度 | 第40-42页 |
| 2.6.5 渗透压的影响 | 第42页 |
| 2.6.6 裂解酶的影响 | 第42页 |
| 2.6.7 酶解时间的影响 | 第42-43页 |
| 2.6.8 原生质体的形态学观察 | 第43-44页 |
| 2.6.9 原生质体的转化 | 第44页 |
| 2.6.10 工程菌的PCR鉴定 | 第44页 |
| 2.6.11 摇瓶发酵转化EP的HPLC检测 | 第44-45页 |
| 2.6.12 黑根霉生物催化EP发酵曲线 | 第45-46页 |
| 2.6.13 基因工程菌NADPH的检测 | 第46-48页 |
| 2.7 本章小结 | 第48-49页 |
| 第三章 黑根霉工程菌培养条件的响应面优化 | 第49-60页 |
| 3.1 引言 | 第49页 |
| 3.2 材料与方法 | 第49-50页 |
| 3.2.1 菌种 | 第49页 |
| 3.2.2 培养基 | 第49页 |
| 3.2.3 试剂及仪器设备 | 第49-50页 |
| 3.3 响应面优化实验设计 | 第50-51页 |
| 3.3.1 PB实验设计 | 第50页 |
| 3.3.2 最陡爬坡实验设计 | 第50-51页 |
| 3.3.3 显著变量的最优化分析 | 第51页 |
| 3.4 统计分析 | 第51-52页 |
| 3.5 转化率的测定 | 第52-54页 |
| 3.6 结果和讨论 | 第54-59页 |
| 3.6.1 通过PB实验筛选重要的影响因子 | 第54-55页 |
| 3.6.2 最陡爬坡实验 | 第55-56页 |
| 3.6.3 中心组合实验和响应面分析 | 第56-59页 |
| 3.7 模型验证 | 第59页 |
| 3.8 本章小结 | 第59-60页 |
| 第四章 黑根霉基因工程菌补糖发酵工艺的研究 | 第60-70页 |
| 4.1 引言 | 第60页 |
| 4.2 材料与方法 | 第60-61页 |
| 4.2.1 菌种 | 第60页 |
| 4.2.2 培养基 | 第60页 |
| 4.2.3 试剂及仪器设备 | 第60页 |
| 4.2.4 分析试剂 | 第60-61页 |
| 4.2.5 培养方法 | 第61页 |
| 4.2.6 葡萄糖的补加方法 | 第61页 |
| 4.3 分析方法 | 第61-63页 |
| 4.3.1 葡萄糖标准曲线的制作 | 第61-62页 |
| 4.3.2 发酵液检测样品的制备 | 第62页 |
| 4.3.3 菌体生物量的测定 | 第62-63页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第63-68页 |
| 4.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制 | 第63页 |
| 4.4.2 不同初始葡萄糖浓度对EP发酵的影响 | 第63-65页 |
| 4.4.3 摇瓶发酵中12h补加葡萄糖对菌体生长和HEP合成的影响 | 第65-66页 |
| 4.4.4 摇瓶发酵中20h补加葡萄糖对菌体生长和HEP合成的影响 | 第66-67页 |
| 4.4.5 摇瓶发酵中28h补加葡萄糖对菌体生长和HEP合成的影响 | 第67-68页 |
| 4.4.6 分批补加葡萄糖对菌体生长和HEP合成的影响 | 第68页 |
| 4.5 本章小结 | 第68-70页 |
| 第五章 结论和展望 | 第70-72页 |
| 5.1 主要结论 | 第70-71页 |
| 5.2 论文展望 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-80页 |
| 附录 | 第80-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第85页 |
