| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩写词与符号 | 第9-14页 |
| 第一部分 综述 | 第14-24页 |
| 1 磷脂简介 | 第14-16页 |
| 1.1 磷脂酰胆碱(PC)的生物合成 | 第15页 |
| 1.2 磷脂酰胆碱(PC)的重要生物学功能 | 第15-16页 |
| 2 丁香假单胞菌 | 第16-17页 |
| 2.1 丁香假单胞菌生物学特征 | 第16页 |
| 2.2 丁香假单胞菌PC合成途径 | 第16-17页 |
| 2.3 磷脂酰胆碱与丁香假单胞菌毒素分泌 | 第17页 |
| 3 丁香假单胞菌毒力因子 | 第17-20页 |
| 3.1 脂肽毒素结构特点,分类及功能 | 第17-18页 |
| 3.2 脂肽毒素的合成 | 第18-20页 |
| 4 细菌Ⅰ型分泌系统 | 第20-22页 |
| 4.1 Ⅰ型分泌系统的组成 | 第20-21页 |
| 4.2 Ⅰ型分泌系统(T1SS)的转运机制 | 第21-22页 |
| 4.3 丁香假单胞菌中的I型分泌系统 | 第22页 |
| 5 研究内容目的,研究意义 | 第22-24页 |
| 5.1 研究内容与目的 | 第22-23页 |
| 5.2 研究意义 | 第23-24页 |
| 第二部分 实验研究 | 第24-64页 |
| 1 实验仪器,材料与试剂 | 第24-31页 |
| 1.1 主要仪器与设备 | 第24-25页 |
| 1.2 实验菌株和载体及引物设计 | 第25-27页 |
| 1.3 主要试剂 | 第27页 |
| 1.4 所用培养基及配制 | 第27-28页 |
| 1.5 主要溶液及配制 | 第28-31页 |
| 1.5.1 细菌总DNA抽提相关试剂 | 第28页 |
| 1.5.2 质粒DNA抽提相关试剂 | 第28页 |
| 1.5.3 DNA电泳相关试剂 | 第28-29页 |
| 1.5.4 诱导表达相关试剂 | 第29页 |
| 1.5.5 SDS-PAGE所用溶液及凝胶的配制 | 第29-30页 |
| 1.5.6 蛋白质的纯化试剂及配制 | 第30页 |
| 1.5.7 透析袋处理及保存相关试剂 | 第30页 |
| 1.5.8 bradford法测蛋白质浓度所需试剂 | 第30-31页 |
| 1.5.9 间接ELISA法检测血清多克隆抗体效价所需试剂 | 第31页 |
| 1.5.10 Western blot相关试剂 | 第31页 |
| 1.5.11 细菌总RNA抽提所需的DEPC水 | 第31页 |
| 2 实验方法 | 第31-46页 |
| 2.1 Ⅰ型分泌系统构件基因pseE、pseF克隆 | 第31-33页 |
| 2.1.1 丁香假单胞菌丁香致病变种1336基因组DNA抽提 | 第31-32页 |
| 2.1.2 pseE,pseF的PCR扩增 | 第32-33页 |
| 2.2 pseE,pseF基因重组表达载体的构建以及蛋白表达 | 第33-37页 |
| 2.2.1 pseE,pseF基因克隆 | 第33-35页 |
| 2.2.2 重组表达载体的构建、转化及携带重组质粒的转化子筛选 | 第35-37页 |
| 2.2.3 蛋白诱导表达及检测 | 第37页 |
| 2.2.4 Tris-甘氨酸SDS-PAGE电泳 | 第37页 |
| 2.3 PseE、PseF蛋白的纯化 | 第37-40页 |
| 2.3.1 包涵体蛋白的处理 | 第38页 |
| 2.3.2 PseE、PseF蛋白的纯化 | 第38页 |
| 2.3.3 Co~(2+)-层析柱的处理 | 第38-40页 |
| 2.3.3.1 琼脂糖凝胶柱的装填 | 第38-39页 |
| 2.3.3.2 Co~(2+)离子螯合 | 第39页 |
| 2.3.3.3 Co~(2+)-层析柱的平衡 | 第39页 |
| 2.3.3.4 蛋白样品上柱 | 第39页 |
| 2.3.3.5 非结合杂蛋白的洗脱 | 第39页 |
| 2.3.3.6 目的蛋白的分步洗脱 | 第39-40页 |
| 2.4 纯化蛋白的浓缩、浓度测定及保藏 | 第40-41页 |
| 2.4.1 蛋白的浓缩 | 第40页 |
| 2.4.2 蛋白浓度测定 | 第40-41页 |
| 2.5 PseE,PseF蛋白多克隆抗体的制备与抗体效价测定 | 第41-42页 |
| 2.5.1 抗PseE、PseF蛋白的多克隆抗体制备 | 第41页 |
| 2.5.2 免疫后血清效价的测定 | 第41-42页 |
| 2.6 丁香假单胞菌胞质蛋白、膜蛋白提取与Western blotting检测 | 第42-43页 |
| 2.6.1 丁香假单胞菌1336, 1336pcs~-蛋白的诱导表达 | 第42页 |
| 2.6.2 丁香假单胞菌1336,1336pcs~-胞质蛋白的制备 | 第42页 |
| 2.6.3 胞质蛋白Western blot检测 | 第42-43页 |
| 2.6.4 丁香假单胞菌1336,1336pcs~-膜蛋白的制备 | 第43页 |
| 2.6.5 膜蛋白Western blot检测 | 第43页 |
| 2.7 RT-PCR(反转录PCR) | 第43-46页 |
| 2.7.1 丁香假单胞杆菌1336野生型和1336pcs~-突变型总RNA提取 | 第43-44页 |
| 2.7.2 反转录反应 | 第44-45页 |
| 2.7.3 pseE、pseF基因转录检测 | 第45-46页 |
| 3 实验结果与分析 | 第46-64页 |
| 3.1 克隆的丁香假单胞菌1336pseE、pseF基因序列 | 第46-50页 |
| 3.1.1 丁香假单胞菌1336基因组DNA抽提 | 第46页 |
| 3.1.2 克隆的pse、EpseF基因序列 | 第46-49页 |
| 3.1.3 克隆的pseE、pseF基因产物的理化性质 | 第49-50页 |
| 3.2 pseE、pseF基因在大肠杆菌中的过量表达 | 第50-55页 |
| 3.2.1 pseE、pseF表达重组质粒构建 | 第50-52页 |
| 3.2.2 表达条件的优化及融合蛋白的检测 | 第52-53页 |
| 3.2.3 pseF_(部分)片段的克隆及pET28a-pseF_(部分)重组质粒的构建 | 第53-54页 |
| 3.2.4 PseF_(部分)融合蛋白诱导表达及检测 | 第54-55页 |
| 3.3 PseE、PseF_(部分)融合蛋白的纯化 | 第55-56页 |
| 3.4 抗PseE、PseF_(部分)的兔抗血清的效价 | 第56-57页 |
| 3.5 pseE、pseF基因在丁香假单胞菌1336野生型和1336pcs~-突变型中的转录量比较 | 第57-59页 |
| 3.6 丁香假单胞菌1336野生型和1336pcs~-突变型胞质蛋白中PseE、PseF蛋白含量比较 | 第59-60页 |
| 3.7 丁香假单胞菌1336野生型和1336pcs~-突变型膜蛋白中PseE、PseF蛋白含量比较 | 第60-62页 |
| 3.8 丁香假单胞菌1336野生型和1336pcs~-突变型中TISS相关基因转录量的比较 | 第62-64页 |
| 第三部分 总结与展望 | 第64-67页 |
| 参考文献 | 第67-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
