| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 英文缩写词表 | 第13-16页 |
| 第1章 引言 | 第16-30页 |
| 1.1 PGRN分子的概述 | 第16页 |
| 1.2 PGRN分子的生物学功能 | 第16-21页 |
| 1.2.1 PGRN在肿瘤中的生物学功能 | 第16-18页 |
| 1.2.2 PGRN在神经退行性疾病中的作用 | 第18页 |
| 1.2.3 PGRN在炎症反应的作用 | 第18-19页 |
| 1.2.4 PGRN在脂类代谢中的作用 | 第19-21页 |
| 1.3 ARID5A的基因定位、分子结构及细胞分布 | 第21-23页 |
| 1.3.1 ARID5A的基因定位和分子结构 | 第22-23页 |
| 1.3.2 ARID5A在组织中的分布及其细胞定位 | 第23页 |
| 1.4 ARID5A分子功能研究现状 | 第23-25页 |
| 1.4.1 ARID5A在心血管组织中的作用 | 第23-24页 |
| 1.4.2 ARID5A在软骨细胞中的作用 | 第24页 |
| 1.4.3 ARID5A在类风湿性关节炎中的作用 | 第24-25页 |
| 1.4.4 ARID5A在炎症反应中的作用 | 第25页 |
| 1.5 课题研究意义 | 第25-26页 |
| 1.6 课题技术路线 | 第26-30页 |
| 1.6.1 ARID5A功能结构域的原核蛋白表达及纯化 | 第26-27页 |
| 1.6.2 ARID5A功能结构域单克隆抗体的制备 | 第27-28页 |
| 1.6.3 ARID5A基因敲除细胞系的建立 | 第28页 |
| 1.6.4 ARID5A介导的PGRN的功能研究 | 第28-30页 |
| 第2章 针对ARID5A N端功能结构域的单克隆抗体制备 | 第30-50页 |
| 2.1 实验材料 | 第31-34页 |
| 2.1.1 载体、质粒、菌种、细胞株 | 第31页 |
| 2.1.2 主要材料试剂 | 第31页 |
| 2.1.3 试剂配制 | 第31-33页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第33-34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-39页 |
| 2.2.1 ARID5A-N-6His原核表达载体的构建 | 第34页 |
| 2.2.2 ARID5A-N-6His原核蛋白的表达与纯化 | 第34-35页 |
| 2.2.3 SDS-PAGE和Western blot检测 | 第35-36页 |
| 2.2.4 ARID5A-N单克隆抗体的制备 | 第36-38页 |
| 2.2.5 抗体亚类分析 | 第38页 |
| 2.2.6 抗体效价检测 | 第38页 |
| 2.2.7 免疫荧光染色 | 第38-39页 |
| 2.2.8 抗体特异性鉴定 | 第39页 |
| 2.3 实验结果 | 第39-47页 |
| 2.3.1 pET-28a/ARID5A-N表达载体的构建及鉴定 | 第39-41页 |
| 2.3.2 ARID5A-N-6His原核蛋白的表达与纯化 | 第41-42页 |
| 2.3.3 ARID5A-N原核蛋白的Western blot检测结果 | 第42-43页 |
| 2.3.4 针对ARID5A-N单克隆抗体的效价检测 | 第43页 |
| 2.3.5 针对ARID5A-N单克隆抗体的抗体亚类分析 | 第43-44页 |
| 2.3.6 针对ARID5A-N单克隆抗体的纯化 | 第44页 |
| 2.3.7 针对ARID5A-N单克隆抗体的特异性检测 | 第44-46页 |
| 2.3.8 针对ARID5A-N单克隆抗体的免疫荧光染色检测 | 第46-47页 |
| 2.4 讨论 | 第47-50页 |
| 第3章 ARID5A敲除的HEK293与MCF-7细胞系的建立 | 第50-70页 |
| 3.1 实验材料 | 第50-51页 |
| 3.1.1 载体、细胞株 | 第50页 |
| 3.1.2 主要材料试剂 | 第50-51页 |
| 3.1.3 主要试剂配制 | 第51页 |
| 3.1.4 引物合成 | 第51页 |
| 3.2 实验方法 | 第51-59页 |
| 3.2.1 靶向ARID5A的sgRNA的设计、表达载体构建及活性测试 | 第51-56页 |
| 3.2.2 Cas9-sgRNA共表达载体与打靶载体的构建 | 第56-58页 |
| 3.2.3 ARID5A敲除的HEK293细胞系的建立与鉴定 | 第58-59页 |
| 3.2.4 ARID5A敲除的MCF-7细胞系的建立与鉴定 | 第59页 |
| 3.3 实验结果 | 第59-68页 |
| 3.3.1 使用T7E1 assay法检测sgRNA打靶活性 | 第59-60页 |
| 3.3.2 ARID5A双等位基因敲除的HEK 293细胞系的建立及鉴定 | 第60-64页 |
| 3.3.3 ARID5A单等位基因敲除的MCF-7细胞系的建立及鉴定 | 第64-68页 |
| 3.4 讨论 | 第68-70页 |
| 第4章 PGRN与ARID5A相互作用对ERα转录激活作用的影响 | 第70-78页 |
| 4.1 实验材料 | 第70-71页 |
| 4.1.1 载体、细胞株 | 第70-71页 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 | 第71页 |
| 4.2 实验方法 | 第71-75页 |
| 4.2.1 载体构建 | 第71-74页 |
| 4.2.2 验证ARID5A对ERα转录激活作用的影响 | 第74页 |
| 4.2.3 探究PGRN与ARID5A相互作用对ERα转录激活作用的影响 | 第74-75页 |
| 4.3 实验结果 | 第75-76页 |
| 4.3.1 ARID5A对ERα转录激活作用的影响 | 第75页 |
| 4.3.2 PGRN与ARID5A相互作用在HEK293细胞中对ERα转录激活作用的影响 | 第75-76页 |
| 4.4 讨论 | 第76-78页 |
| 第5章 PGRN与ARID5A相互作用对细胞增殖的影响 | 第78-90页 |
| 5.1 实验材料 | 第78-79页 |
| 5.1.1 载体、细胞株 | 第78页 |
| 5.1.2 主要材料试剂 | 第78页 |
| 5.1.3 试剂配制 | 第78-79页 |
| 5.1.4 主要仪器 | 第79页 |
| 5.2 实验方法 | 第79-80页 |
| 5.2.1 MTT法检测ARID5A基因敲除对HEK293细胞增殖的影响 | 第79-80页 |
| 5.2.2 MTT法检测PGRN和ARID5A过表达对HEK293细胞增殖的影响 | 第80页 |
| 5.2.3 MTT法检测ARID5A过表达和ARID5A单等位基因敲除对MCF-7细胞增殖的影响 | 第80页 |
| 5.3 实验结果 | 第80-86页 |
| 5.3.1 ARID5A过表达对HEK293细胞增殖的影响 | 第80-81页 |
| 5.3.2 ARID5A基因敲除对HEK293细胞增殖的影响 | 第81-82页 |
| 5.3.3 PGRN与ARID5A相互作用对细胞增殖影响的分子机制 | 第82-84页 |
| 5.3.4 ARID5A过表达对MCF-7细胞增殖的影响 | 第84-85页 |
| 5.3.5 ARID5A单等位基因敲除对MCF-7细胞增殖的影响 | 第85-86页 |
| 5.4 讨论 | 第86-90页 |
| 第6章 结论 | 第90-92页 |
| 参考文献 | 第92-100页 |
| 附录 | 第100-106页 |
| 致谢 | 第106-108页 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 | 第108页 |
