| 摘要 | 第5-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 主要符号表 | 第8-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-29页 |
| 1.1 热稳定性酶概述 | 第13-17页 |
| 1.1.1 酶热稳定性的定义及其常用表示方法 | 第13-14页 |
| 1.1.2 热稳定性酶的应用 | 第14页 |
| 1.1.3 影响酶热稳定性的因素 | 第14-17页 |
| 1.2 酶分子热稳定性改造策略 | 第17-26页 |
| 1.2.1 非理性设计 | 第17-18页 |
| 1.2.2 理性设计 | 第18-21页 |
| 1.2.3 半理性设计 | 第21-26页 |
| 1.3 偏甘油酯脂肪酶 | 第26-28页 |
| 1.3.1 偏甘油酯脂肪酶SMG | 第27页 |
| 1.3.2 偏甘油酯脂肪酶PCL | 第27-28页 |
| 1.4 本课题研究意义和主要内容 | 第28-29页 |
| 第二章 计算机设计SMG1热稳定性突变体 | 第29-42页 |
| 2.1 引言 | 第29页 |
| 2.2 实验材料 | 第29-30页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第29页 |
| 2.2.2 培养基及溶液配制 | 第29-30页 |
| 2.2.3 引物合成与DNA测序 | 第30页 |
| 2.2.4 主要仪器 | 第30页 |
| 2.2.5 计算分析软件 | 第30页 |
| 2.3 突变体设计与构建 | 第30-34页 |
| 2.3.1 突变体设计 | 第31-32页 |
| 2.3.2 突变体构建 | 第32-34页 |
| 2.4 实验结果 | 第34-41页 |
| 2.4.1 Rosetta计算后筛选得到的有益突变体 | 第34-36页 |
| 2.4.2 FoldX计算筛选后得到的有益突变体 | 第36-37页 |
| 2.4.3 ABACUS计算筛选后得到的有益突变体 | 第37-39页 |
| 2.4.4 结构上合理位点 | 第39-41页 |
| 2.5 本章小结 | 第41-42页 |
| 第三章 SMG1突变体表达纯化和热稳定性分析 | 第42-57页 |
| 3.1 引言 | 第42页 |
| 3.2 实验材料 | 第42页 |
| 3.2.1 表达菌株 | 第42页 |
| 3.2.2 培养基 | 第42页 |
| 3.3 实验方法 | 第42-44页 |
| 3.3.1 突变质粒和表达菌株构建 | 第42页 |
| 3.3.2 SMG1和突变体蛋白诱导表达 | 第42-43页 |
| 3.3.3 菌液处理 | 第43页 |
| 3.3.4 目的蛋白纯化和热稳定性检测 | 第43-44页 |
| 3.4 叠加突变体构建与热稳定性检测 | 第44页 |
| 3.4.1 叠加突变体构建 | 第44页 |
| 3.4.2 叠加突变体表达纯化及热稳定性检测 | 第44页 |
| 3.5 叠加突变体酶活性及酶学性质检测 | 第44-45页 |
| 3.6 二轮计算机设计突变体 | 第45页 |
| 3.7 实验结果 | 第45-55页 |
| 3.7.1 突变体蛋白表达情况汇总 | 第45-47页 |
| 3.7.2 突变体Tm值测定结果汇总 | 第47-49页 |
| 3.7.3 叠加突变体构建路线和表达情况 | 第49-51页 |
| 3.7.4 叠加突变体热稳定性及酶学性质测定 | 第51-54页 |
| 3.7.5 二轮计算筛选突变体 | 第54页 |
| 3.7.6 二轮计算突变体构建、表达及热稳定性测定 | 第54-55页 |
| 3.7.7 最优突变体酶活性测定 | 第55页 |
| 3.8 本章小结 | 第55-57页 |
| 第四章 氨基酸替换结合结构分析对PCL热稳定性改造 | 第57-74页 |
| 4.1 引言 | 第57页 |
| 4.2 突变体设计思路 | 第57-58页 |
| 4.3 实验方法 | 第58-61页 |
| 4.3.1 突变体构建 | 第58-60页 |
| 4.3.2 突变体表达和纯化 | 第60-61页 |
| 4.4 活性检测、热稳定性评估及其它酶学性质测定 | 第61-63页 |
| 4.4.1 滴定法测定酶活 | 第61-62页 |
| 4.4.2 热稳定评估 | 第62页 |
| 4.4.3 PCL与突变体生化性质测定 | 第62页 |
| 4.4.4 Km、Kcat值测定 | 第62-63页 |
| 4.5 动力学（MD）分析热稳定性 | 第63页 |
| 4.6 实验结果 | 第63-73页 |
| 4.6.1 突变体设计结果 | 第63-68页 |
| 4.6.2 突变体纯化结果 | 第68-69页 |
| 4.6.3 Tm值和T1/2值测定结果 | 第69-70页 |
| 4.6.4 生化性质测定 | 第70页 |
| 4.6.5 Km、Kcat值测定结果 | 第70-71页 |
| 4.6.6 动力学结果分析 | 第71-73页 |
| 4.7 本章小结 | 第73-74页 |
| 第五章 两种热稳定性改造方法总结和比较 | 第74-78页 |
| 5.1 引言 | 第74页 |
| 5.2 两种热稳定性改造方法总结 | 第74-77页 |
| 5.2.1 计算机结合结构分析的蛋白质热稳定性设计 | 第74-75页 |
| 5.2.2 氨基酸替换结合蛋白质的结构分析的蛋白质热稳定性设计 | 第75-76页 |
| 5.2.3 两种酶热稳定性方法比较 | 第76-77页 |
| 5.3 本章小结 | 第77-78页 |
| 结论与展望 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-89页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第89-90页 |
| 致谢 | 第90-92页 |
| 附件 | 第92页 |
