| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩写词表 | 第12-18页 |
| 1 文献综述 | 第18-42页 |
| 1.1 虾青素的概述 | 第18-20页 |
| 1.1.1 虾青素的简介 | 第18页 |
| 1.1.2 虾青素的理化性质 | 第18-19页 |
| 1.1.3 虾青素的生理功能与应用 | 第19-20页 |
| 1.2 虾青素的生产方法与现状 | 第20-23页 |
| 1.2.1 化学合成 | 第20-21页 |
| 1.2.2 生物提取 | 第21-23页 |
| 1.3 虾青素的生物合成途径 | 第23-25页 |
| 1.4 虾青素的异源合成研究进展 | 第25-32页 |
| 1.4.1 利用细菌异源合成虾青素的研究进展 | 第25-29页 |
| 1.4.2 利用酵母异源合成虾青素的研究进展 | 第29-32页 |
| 1.5 代谢改造酿酒酵母生产萜类化合物的研究 | 第32-35页 |
| 1.5.1 酿酒酵母生产的代表性萜类化合物 | 第33页 |
| 1.5.2 酿酒酵母中生产萜类化合物的代谢途径工程研究 | 第33-35页 |
| 1.6 合成生物学研究中常用的代谢调控策略 | 第35-40页 |
| 1.7 本课题研究的内容与意义 | 第40-42页 |
| 2 虾青素生物合成途径基因的克隆与表达 | 第42-69页 |
| 2.1 前言 | 第42-43页 |
| 2.2 实验设备与材料 | 第43-48页 |
| 2.2.1 仪器设备 | 第43-44页 |
| 2.2.2 试剂和引物 | 第44-46页 |
| 2.2.3 菌株和质粒 | 第46-47页 |
| 2.2.4 主要溶液及培养基配置 | 第47-48页 |
| 2.3 实验方法 | 第48-57页 |
| 2.3.1 雨生红球藻RNA:的抽提与基因的反转录 | 第48-50页 |
| 2.3.2 分子克隆实验 | 第50-52页 |
| 2.3.3 酿酒酵母转化方法 | 第52-53页 |
| 2.3.4 酿酒酵母的整合基因型验证 | 第53页 |
| 2.3.5 pUMRI质粒的整合与选择标记的去除 | 第53-55页 |
| 2.3.6 酿酒酵母的摇瓶培养 | 第55页 |
| 2.3.7 定性和定量分析荧光强度 | 第55页 |
| 2.3.8 类胡萝卜素的抽提与检测分析 | 第55-57页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第57-67页 |
| 2.4.1 虾青素和β-胡萝卜素标准曲线的建立 | 第57页 |
| 2.4.2 crtZ和bkt基因的克隆 | 第57-58页 |
| 2.4.3 整合crtZ和bkt基因合成虾青素 | 第58-59页 |
| 2.4.4 crtZ和bkt的密码子优化 | 第59-63页 |
| 2.4.5 虾青素构型的测定 | 第63-64页 |
| 2.4.6 CrtZ和BKIT的底物选择性分析 | 第64-66页 |
| 2.4.7 OcrtZ和Obkt基因拷贝数对虾青素产量的影响 | 第66-67页 |
| 2.5 本章小结 | 第67-69页 |
| 3 结合定向进化与代谢工程调控限速酶提高虾青素产量 | 第69-97页 |
| 3.1 前言 | 第69-70页 |
| 3.2 实验材料与试剂 | 第70-74页 |
| 3.3 实验方法 | 第74-82页 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 | 第74-76页 |
| 3.3.2 OBKITM的定向进化流程 | 第76-77页 |
| 3.3.3 融合蛋白的构建 | 第77页 |
| 3.3.4 OBKITM和OCrtZ的共定向进化 | 第77-78页 |
| 3.3.5 重组菌株的构建流程 | 第78-80页 |
| 3.3.6 菌株的稳定性分析 | 第80-81页 |
| 3.3.7 菌株的培养和类胡萝卜素产物分析 | 第81页 |
| 3.3.8 角黄素标曲的测定 | 第81-82页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第82-95页 |
| 3.4.1 Fe~(2+)辅因子对虾青素合成的影响 | 第82-84页 |
| 3.4.2 表达CrtE03M对前体物质β-胡萝卜素产量的影响 | 第84页 |
| 3.4.3 OBKT的定向进化 | 第84-87页 |
| 3.4.4 CrtE03M和OBKTM对虾青素产量的影响 | 第87-89页 |
| 3.4.5 YastD-03双倍体菌株产虾青素的稳定性分析 | 第89-91页 |
| 3.4.6 OCrtZ和OBKIM融合表达 | 第91页 |
| 3.4.7 OCrtZ和OBKITM共定向进化 | 第91-95页 |
| 3.5 本章小结 | 第95-97页 |
| 4 酿酒酵母温度响应蛋白开关的设计与构建 | 第97-121页 |
| 4.1 前言 | 第97-98页 |
| 4.2 实验材料与试剂 | 第98-102页 |
| 4.2.1 试剂和引物 | 第98-101页 |
| 4.2.2 菌株 | 第101-102页 |
| 4.3 实验方法 | 第102-107页 |
| 4.3.1 基因的扩增与质粒的构建 | 第102-103页 |
| 4.3.2 GAL4基因的敲除 | 第103页 |
| 4.3.3 温敏型Gal4的定向进化 | 第103-104页 |
| 4.3.4 荧光显微镜和流式细胞仪分析EGFP的强度 | 第104页 |
| 4.3.5 实时荧光定量PCR | 第104-105页 |
| 4.3.6 培养基中葡萄糖浓度的测定 | 第105页 |
| 4.3.7 乙醇标曲的制作与发酵液中乙醇含量的测定 | 第105-106页 |
| 4.3.8 番茄红素的抽提与分析 | 第106-107页 |
| 4.3.9 分批补料发酵 | 第107页 |
| 4.4 实验结果 | 第107-119页 |
| 4.4.1 温度响应的动态调控系统设计 | 第107-108页 |
| 4.4.2 温敏型Gal4定向进化高通量筛选方法的建立 | 第108-110页 |
| 4.4.3 温敏型Gal4突变体的筛选和鉴定 | 第110-113页 |
| 4.4.4 温度对温敏型Gal4调控系统的影响 | 第113-114页 |
| 4.4.5 Gal4温敏型调控系统的表征 | 第114-116页 |
| 4.4.6 温度调控系统在番茄红素合成中的应用 | 第116-118页 |
| 4.4.7 利用温度调控系统进行番茄红素的两阶段发酵生产 | 第118-119页 |
| 4.5 本章小结 | 第119-121页 |
| 5 温度响应型虾青素生物合成途径的构建 | 第121-127页 |
| 5.1 引言 | 第121-122页 |
| 5.2 材料和试剂 | 第122页 |
| 5.3 实验方法 | 第122-123页 |
| 5.3.1 表达载体的构建 | 第122页 |
| 5.3.2 菌株的构建 | 第122-123页 |
| 5.3.3 产虾青素菌株的摇瓶培养 | 第123页 |
| 5.3.4 产虾青素菌株的高密度发酵 | 第123页 |
| 5.4 实验结果与讨论 | 第123-126页 |
| 5.4.1 温度调控的虾青素合成菌株的构建与表征 | 第123-125页 |
| 5.4.2 虾青素的高密度发酵生产 | 第125-126页 |
| 5.5 本章小结 | 第126-127页 |
| 6 结论与展望 | 第127-131页 |
| 6.1 结论 | 第127-128页 |
| 6.2 展望 | 第128-131页 |
| 参考文献 | 第131-149页 |
| 附录 | 第149-151页 |
| 作者简历及攻读博士学位期间的研究成果 | 第151-152页 |
