| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 绪论 | 第11-21页 |
| 1.1 组织蛋白酶 D 的产生、合成、转运与激活 | 第11-13页 |
| 1.2 组织蛋白酶 D 参与多种体内生理学活动 | 第13-15页 |
| 1.2.1 组织蛋白酶 D 参与不同底物水解 | 第13-15页 |
| 1.2.2 组织蛋白酶 D 参与表皮分化 | 第15页 |
| 1.2.3 组织蛋白酶 D 参与细胞凋亡 | 第15页 |
| 1.3 组织蛋白酶 D 参与多种体内病理学活动 | 第15-20页 |
| 1.3.1 组织蛋白酶 D 与阿尔茨海默病 | 第15-16页 |
| 1.3.2 组织蛋白酶 D 与动脉粥样硬化 | 第16-17页 |
| 1.3.3 组织蛋白酶 D 与先天性肌肉萎缩 | 第17页 |
| 1.3.4 组织蛋白酶 D 与癌症 | 第17-20页 |
| 1.4 问题与展望 | 第20-21页 |
| 2 七鳃鳗 CTSD 基因的分子克隆 | 第21-43页 |
| 2.1 材料 | 第21-22页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第21页 |
| 2.1.2 仪器设备 | 第21-22页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第22页 |
| 2.2 方法 | 第22-37页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第22-23页 |
| 2.2.2 七鳃鳗口腔腺 Total RNA 的提取 | 第23-24页 |
| 2.2.3 七鳃鳗口腔腺 cDNA 模板制备 | 第24-26页 |
| 2.2.4 七鳃鳗 CTSD 基因的扩增 | 第26页 |
| 2.2.5 目的片段的回收 | 第26-27页 |
| 2.2.6 目的片段与 T 载体的连接及转化 | 第27-28页 |
| 2.2.7 阳性转化子的鉴定 | 第28-29页 |
| 2.2.8 重组质粒 DNA 小量纯化及测序 | 第29页 |
| 2.2.9 3’末端快速扩增反应 | 第29-32页 |
| 2.2.10 5’末端快速扩增反应 | 第32-36页 |
| 2.2.11 cDNA 全长序列拼接及 ORF 片段扩增 | 第36-37页 |
| 2.3 结果 | 第37-41页 |
| 2.3.1 七鳃鳗口腔腺 Toal RNA 的提取 | 第37-38页 |
| 2.3.2 七鳃鳗 CTSD 基因的克隆及 3’和 5’末端快速扩增反应 | 第38-39页 |
| 2.3.3 七鳃鳗 CTSD 基因的 cDNA 全长的序列拼接及最终验证 | 第39-41页 |
| 2.4 讨论 | 第41-42页 |
| 2.5 小结 | 第42-43页 |
| 3 七鳃鳗 CTSD 的生物信息学分析 | 第43-59页 |
| 3.1 生物信息学分析所需软件和数据库 | 第43页 |
| 3.2 结果 | 第43-57页 |
| 3.2.1 七鳃鳗 CTSD 的理化性质分析 | 第43-45页 |
| 3.2.2 蛋白质二级结构和结构域分析 | 第45-49页 |
| 3.2.3 三级结构模拟 | 第49-50页 |
| 3.2.4 同源序列比对 | 第50-52页 |
| 3.2.5 保守基序分析 | 第52-56页 |
| 3.2.6 系统发育分析 | 第56-57页 |
| 3.3 讨论 | 第57页 |
| 3.4 小结 | 第57-59页 |
| 4 实时定量 PCR 法检测 L-CTSD 基因在七鳃鳗各组织中的表达谱 | 第59-65页 |
| 4.1 材料 | 第59-60页 |
| 4.1.1 实验动物 | 第59页 |
| 4.1.2 仪器设备 | 第59-60页 |
| 4.1.3 实验试剂 | 第60页 |
| 4.2 实验方法 | 第60-62页 |
| 4.2.1 免疫刺激 | 第60页 |
| 4.2.2 Total RNA 的提取与检测 | 第60页 |
| 4.2.3 引物设计 | 第60-61页 |
| 4.2.4 Real Time PCR 反应 | 第61-62页 |
| 4.3 结果 | 第62-64页 |
| 4.3.1 七鳃鳗各组织 Total RNA 的提取 | 第62-63页 |
| 4.3.2 L-CTSD 基因在七鳃鳗不同组织中的相对表达谱分析 | 第63-64页 |
| 4.4 讨论 | 第64页 |
| 4.5 小结 | 第64-65页 |
| 5 pColdⅠ-CTSD 表达载体的构建及重组蛋白的纯化鉴定 | 第65-80页 |
| 5.1 材料 | 第65-66页 |
| 5.1.1 实验材料 | 第65页 |
| 5.1.2 仪器设备 | 第65-66页 |
| 5.1.3 实验试剂 | 第66页 |
| 5.2 实验方法 | 第66-73页 |
| 5.2.1 引物设计 | 第66页 |
| 5.2.2 PCR 扩增 | 第66-67页 |
| 5.2.3 目的片段的回收与双酶切 | 第67-68页 |
| 5.2.4 目的片段与载体的连接及转化 | 第68页 |
| 5.2.5 重组表达菌的鉴定 | 第68页 |
| 5.2.6 重组蛋白的诱导表达 | 第68-69页 |
| 5.2.7 表达菌的小量超声破碎 | 第69页 |
| 5.2.8 包涵体重组蛋白的提取和鉴定 | 第69-70页 |
| 5.2.9 包涵体纯化 | 第70-71页 |
| 5.2.10 包涵体透析复性 | 第71页 |
| 5.2.11 蛋白质浓缩 | 第71页 |
| 5.2.12 蛋白质浓度测定 | 第71-72页 |
| 5.2.13 质谱鉴定 | 第72页 |
| 5.2.14 rL-CTSD 对牛血红蛋白的酶切活性检测 | 第72-73页 |
| 5.3 结果 | 第73-78页 |
| 5.3.1 pColdⅠ-CTSD 表达载体的构建及测序 | 第73-74页 |
| 5.3.2 七鳃鳗 CTSD 蛋白的诱导表达与纯化 | 第74-76页 |
| 5.3.3 重组七鳃鳗 CTSD 的质谱鉴定 | 第76-77页 |
| 5.3.4 rL-CTSD 对牛血红蛋白的酶切活性检测 | 第77-78页 |
| 5.4 讨论 | 第78-79页 |
| 5.5 小结 | 第79-80页 |
| 结论 | 第80-81页 |
| 本论文的创新点 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-86页 |
| 附录A 不同物种 CTSD 的 FASTA 格式氨基酸序列 | 第86-92页 |
| 附录B 表达载体 pColdⅠ质粒图谱 | 第92-93页 |
| 附录 C BCA 蛋白质浓度测定标准曲线 | 第93-94页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第94-95页 |
| 致谢 | 第95页 |
