| 英文缩略词 | 第4-10页 |
| 中文摘要 | 第10-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 引言 | 第13-22页 |
| 1.1 纤维素及纤维素酶概况 | 第13-14页 |
| 1.2 嗜热真菌研究概况 | 第14页 |
| 1.3 β-葡萄糖苷酶 | 第14-19页 |
| 1.3.1 β-葡萄糖苷酶的概况 | 第14-15页 |
| 1.3.2 β-葡萄糖苷酶的理化性质 | 第15页 |
| 1.3.3 β-葡萄糖苷酶的结构和功能研究 | 第15-16页 |
| 1.3.4 β-葡萄糖苷酶的催化机制 | 第16-18页 |
| 1.3.5 β-葡萄糖苷酶的应用 | 第18-19页 |
| 1.3.5.1 β-葡萄糖苷酶在大豆异黄酮水解中的应用 | 第18页 |
| 1.3.5.2 β-葡萄糖苷酶在清洁燃料生产上的应用 | 第18-19页 |
| 1.4 β-葡萄糖苷酶的分子改造 | 第19-20页 |
| 1.5 研究内容及意义 | 第20-22页 |
| 1.5.1 技术路线 | 第20页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第20-21页 |
| 1.5.3 研究意义 | 第21-22页 |
| 2 材料与方法 | 第22-39页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-23页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第22页 |
| 2.1.2 生物信息学分析网站和软件 | 第22页 |
| 2.1.3 酶与生化试剂 | 第22页 |
| 2.1.4 培养基及溶液配制 | 第22-23页 |
| 2.2 嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶基因bgl3的克隆 | 第23-26页 |
| 2.2.1 嗜热毛壳菌RNA的提取 | 第23-24页 |
| 2.2.2 cDNA的合成 | 第24页 |
| 2.2.3 PCR扩增bgl3基因 | 第24-26页 |
| 2.2.3.1 引物设计 | 第24-25页 |
| 2.2.3.2 PCR扩增体系 | 第25页 |
| 2.2.3.3 PCR扩增条件 | 第25页 |
| 2.2.3.4 目的条带胶条回收 | 第25-26页 |
| 2.3 β-葡萄糖苷酶 BGL3 酵母工程菌的获得 | 第26-30页 |
| 2.3.1 线性化pPIC9K载体的制备 | 第26页 |
| 2.3.1.1 酶切反应体系 | 第26页 |
| 2.3.1.2 线性化程度检测 | 第26页 |
| 2.3.2 目的基因片段和pPIC9K线性化载体的连接 | 第26-27页 |
| 2.3.2.1 必克隆反应体系 | 第26-27页 |
| 2.3.3 大肠杆菌的转化 | 第27页 |
| 2.3.3.1 阳性重组转化子的鉴定 | 第27页 |
| 2.3.4 重组质粒pPIC9K-bgl3的线性化和去磷酸化 | 第27-28页 |
| 2.3.4.1 重组质粒pPIC9K-bgl3酶切反应体系 | 第27-28页 |
| 2.3.4.2 重组质粒pPIC9K-bgl3线性化回收 | 第28页 |
| 2.3.5 重组质粒pPIC9K-bgl3转化毕赤酵母GS115感受态细胞 | 第28-29页 |
| 2.3.5.1 制备毕赤酵母GS115感受态细胞 | 第28页 |
| 2.3.5.2 重组质粒pPIC9K-bgl3电击转入毕赤酵母GS115感受态细胞 | 第28-29页 |
| 2.3.6 重组质粒pPIC9K-bgl3酵母工程菌的筛选 | 第29页 |
| 2.3.7 重组质粒pPIC9K-bgl3酵母工程菌的验证 | 第29-30页 |
| 2.3.7.1 PCR反应体系 | 第29页 |
| 2.3.7.2 PCR反应条件 | 第29-30页 |
| 2.4 pPIC9K-bgl3酵母工程菌的诱导表达和分离纯化 | 第30-31页 |
| 2.4.1 pPIC9K-bgl3酵母工程菌的诱导表达 | 第30页 |
| 2.4.2 表达产物的分离和纯化 | 第30-31页 |
| 2.4.2.1 纯化产物浓度的测定 | 第30-31页 |
| 2.4.2.2 纯化产物的SDS-PAGE分析 | 第31页 |
| 2.5 β-葡萄糖苷酶BGL3的分子改造 | 第31-37页 |
| 2.5.1 β-葡萄糖苷酶BGL3非保守氨基酸的定点突变 | 第31-34页 |
| 2.5.1.1 β-葡萄糖苷酶BGL3非保守氨基酸突变位点的获取 | 第31-33页 |
| 2.5.1.2 PCR产物的消化 | 第33页 |
| 2.5.1.3 消化产物转化大肠杆菌 | 第33-34页 |
| 2.5.1.4 阳性转化子的PCR鉴定 | 第34页 |
| 2.5.1.5 突变体酵母工程菌的获得 | 第34页 |
| 2.5.1.6 突变体酵母工程菌诱导蛋白的分离和纯化 | 第34页 |
| 2.5.2 β-葡萄糖苷酶BGL3底物结合氨基酸的丙氨酸筛选和分析 | 第34-37页 |
| 2.5.2.1 β-葡萄糖苷酶BGL3底物结合氨基酸突变位点的获取 | 第34-36页 |
| 2.5.2.2 PCR产物的消化和转化大肠杆菌 | 第36页 |
| 2.5.2.3 阳性转化子的PCR鉴定 | 第36页 |
| 2.5.2.4 突变质粒的基因测序结果 | 第36-37页 |
| 2.5.2.5 突变体酵母工程菌的获得 | 第37页 |
| 2.6 野生型β-葡萄糖苷酶BGL3和其突变酶的酶学性质研究 | 第37-38页 |
| 2.6.1 野生酶BGL3和突变酶的比活力测定 | 第37页 |
| 2.6.1.1 DNS法测定野生酶BGL3和突变酶的酶活力 | 第37页 |
| 2.6.1.2 DNS-葡萄糖标准曲线的配制 | 第37页 |
| 2.6.1.3 野生酶BGL3和突变酶的比活力测定方法 | 第37页 |
| 2.6.2 野生酶BGL3和突变酶的反应的最适pH测定 | 第37-38页 |
| 2.6.3 野生酶BGL3和突变酶反应的最适温度测定 | 第38页 |
| 2.6.4 野生酶BGL3和突变酶的热稳定性测定 | 第38页 |
| 2.6.5 野生酶BGL3和突变酶的动力学参数测定 | 第38页 |
| 2.7 嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶BGL3及其突变酶的三维建模 | 第38-39页 |
| 3 结果与分析 | 第39-56页 |
| 3.1 嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶基因bgl3的真核表达与分析 | 第39-45页 |
| 3.1.1 β-葡萄糖苷酶基因bgl3片段的克隆和序列分析 | 第39-41页 |
| 3.1.1.1 嗜热毛壳菌总RNA的提取和基因bgl3的克隆 | 第39-40页 |
| 3.1.1.2 基因bgl3序列的测定和分析 | 第40-41页 |
| 3.1.2 β-葡萄糖苷酶BGL3酵母工程菌的获得 | 第41-42页 |
| 3.1.2.1 重组质粒pPIC9K-bgl3的线性化、去磷酸化以及电击转入酵母细胞 | 第41页 |
| 3.1.2.2 阳性酵母工程菌的鉴定 | 第41-42页 |
| 3.1.3 pPIC9K-bgl3酵母工程菌的诱导表达和分离纯化 | 第42-43页 |
| 3.1.3.1 pPIC9K-bgl3酵母工程菌的诱导表达及纯化 | 第42-43页 |
| 3.1.4 β-葡萄糖苷酶BGL3的酶学性质研究 | 第43-45页 |
| 3.1.4.1 β-葡萄糖苷酶BGL3的比活力测定 | 第43-44页 |
| 3.1.4.2 β-葡萄糖苷酶BGL3反应的最适pH值测定 | 第44页 |
| 3.1.4.3 β-葡萄糖苷酶BGL3的反应的最适温度测定 | 第44页 |
| 3.1.4.4 β-葡萄糖苷酶BGL3的热稳定性测定 | 第44-45页 |
| 3.1.4.5 β-葡萄糖苷酶BGL3的动力学参数测定 | 第45页 |
| 3.2 β-葡萄糖苷酶非保守氨基酸突变基因的真核表达及分析 | 第45-50页 |
| 3.2.1 β-葡萄糖苷酶非保守氨基酸突变基因的获取 | 第45-46页 |
| 3.2.2 突变体酵母工程菌的获得 | 第46-47页 |
| 3.2.2.1 突变体酵母工程菌的PCR鉴定 | 第46-47页 |
| 3.2.3 突变体蛋白的表达和纯化及SDS-PAGE分析 | 第47页 |
| 3.2.4 突变酶的酶学性质测定 | 第47-50页 |
| 3.2.4.1 突变酶的比活力测定 | 第47页 |
| 3.2.4.2 突变酶反应的最适pH测定 | 第47-48页 |
| 3.2.4.3 突变酶反应的最适温度测定 | 第48-49页 |
| 3.2.4.5 突变酶动力学参数的测定 | 第49-50页 |
| 3.3 β-葡萄糖苷酶底物结合位点突变基因的真核表达及分析 | 第50-56页 |
| 3.3.1 β-葡萄糖苷酶底物结合氨基酸突变位点的获取 | 第50页 |
| 3.3.1.1 突变质粒的基因验证 | 第50页 |
| 3.3.2 突变体酵母工程菌的获得 | 第50-51页 |
| 3.3.3 突变体蛋白的表达和纯化及SDS-PAGE分析 | 第51页 |
| 3.3.4 突变酶的酶学性质测定 | 第51-54页 |
| 3.3.4.1 突变酶的比活力测定 | 第51-52页 |
| 3.3.4.2 突变酶反应的最适pH测定 | 第52页 |
| 3.3.4.3 突变酶的反应的最适温度测定 | 第52-53页 |
| 3.3.4.4 突变酶的热稳定性测定 | 第53页 |
| 3.3.4.5 突变酶的动力学参数的测定 | 第53-54页 |
| 3.3.5 BGL3和底物结合氨基酸位点突变酶的三维结构比较 | 第54-56页 |
| 4 讨论 | 第56-58页 |
| 4.1 β-葡萄糖苷酶的定点突变 | 第56页 |
| 4.2 β-葡萄糖苷酶的酶活性质测定 | 第56-57页 |
| 4.3 β-葡萄糖苷酶底物结合关键氨基酸位点的筛选 | 第57-58页 |
| 5 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
