| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 引言与综述 | 第10-20页 |
| 1.1 林可霉素及其生产菌 | 第10页 |
| 1.1.1 林可霉素与其抗菌机理 | 第10页 |
| 1.1.2 林可霉素的生产菌 | 第10页 |
| 1.2 林可霉素的生物合成途径 | 第10-13页 |
| 1.2.1 林可霉素的分子结构 | 第10-11页 |
| 1.2.2 林可霉素的生物合成 | 第11页 |
| 1.2.3 林可霉素生物合成途径中的PPL途径 | 第11-13页 |
| 1.2.4 林可霉素生物合成途径中的MTL途径 | 第13页 |
| 1.3 林可霉素生物合成基因簇 | 第13-14页 |
| 1.4 林可霉素生物合成相关基因功能分析 | 第14-15页 |
| 1.4.1 抗性基因 | 第14页 |
| 1.4.2 PPL途径基因 | 第14-15页 |
| 1.4.3 MTL途径基因 | 第15页 |
| 1.4.4 调控基因 | 第15页 |
| 1.5 链霉菌次级代谢调控网络 | 第15-17页 |
| 1.6 顺式作用元件与反式作用因子相互作用的检测 | 第17-18页 |
| 1.6.1 基因的表达调控 | 第17-18页 |
| 1.6.2 凝胶迁移实验(EMSA) | 第18页 |
| 1.7 本课题的研究意义和目标 | 第18-20页 |
| 第2章 材料与方法 | 第20-45页 |
| 2.1 药品试剂与仪器 | 第20-31页 |
| 2.1.1 化学药品与生物试剂 | 第20-22页 |
| 2.1.2 培养基 | 第22-23页 |
| 2.1.3 缓冲液 | 第23-24页 |
| 2.1.4 菌种 | 第24-25页 |
| 2.1.5 质粒 | 第25页 |
| 2.1.7 引物 | 第25-29页 |
| 2.1.8 抗生素及诱导剂 | 第29-30页 |
| 2.1.9 仪器与设备 | 第30-31页 |
| 2.2 微生物学方法 | 第31页 |
| 2.2.1 微生物培养条件 | 第31页 |
| 2.2.2 菌种的保藏 | 第31页 |
| 2.3 遗传学方法 | 第31-32页 |
| 2.3.1 制备大肠杆菌感受态细胞 | 第31-32页 |
| 2.3.2 大肠杆菌的转化(Ca~(2+)转化) | 第32页 |
| 2.3.3 链霉菌的接合转移 | 第32页 |
| 2.4 分子生物学方法 | 第32-44页 |
| 2.4.1 大肠杆菌质粒DNA的抽提 | 第33页 |
| 2.4.2 链霉菌染色体DNA的抽提 | 第33页 |
| 2.4.3 聚合酶链式反应(PCR) | 第33页 |
| 2.4.4 质粒或DNA片段的酶切 | 第33-34页 |
| 2.4.5 DNA与载体的连接(粘性末端连接) | 第34页 |
| 2.4.6 多片段无缝克隆 | 第34-36页 |
| 2.4.7 DNA的琼脂糖凝胶回收 | 第36页 |
| 2.4.8 大肠杆菌RNA的抽提 | 第36页 |
| 2.4.9 链霉菌RNA的抽提 | 第36页 |
| 2.4.10 逆转录PCR (RT-PCR) | 第36-37页 |
| 2.4.11 实时荧光定量PCR (qRT-PCR) | 第37-38页 |
| 2.4.12 LmbU蛋白的表达和纯化 | 第38-39页 |
| 2.4.13 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第39-41页 |
| 2.4.14 凝胶迁移实验(EMSA) | 第41-42页 |
| 2.4.15 DNaseI足迹实验( DNase I footprinting assay) | 第42-43页 |
| 2.4.16 林可霉素的分离纯化与HPLC检测 | 第43-44页 |
| 2.5 本课题所用软件及数据库 | 第44-45页 |
| 第3章 结果与分析 | 第45-78页 |
| 3.1 林可霉素生物合成相关基因lmbU编码产物的信息生物学分析 | 第45-46页 |
| 3.1.1 lmbU基因在产林可霉素链霉菌中的保守性 | 第45页 |
| 3.1.2 lmbU编码产物的结构预测和分析 | 第45-46页 |
| 3.2 lmbU基因为林可霉素生物合成所必需 | 第46-48页 |
| 3.2.1 HPLC-MS检测野生株和lmbU基因缺失株的发酵产物 | 第46-47页 |
| 3.2.2 lmbU基因的缺失对林可链霉菌生长、孢子形成以及发酵液颜色的影响 | 第47-48页 |
| 3.3 LmbU蛋白与基因簇内多个基因的上游区域的结合作用 | 第48-55页 |
| 3.3.1 基因簇内部分基因上游区域的克隆 | 第48-50页 |
| 3.3.2 LmbU蛋白异源表达与纯化分析 | 第50页 |
| 3.3.3 LmbU与基因簇基因上游区域的结合 | 第50-52页 |
| 3.3.4 DNase I足迹实验分析lmbWp,lmbCp和lmbKp区域 | 第52-55页 |
| 3.4 LmbU对林可霉素生物合成基因簇部分基因的转录影响 | 第55-57页 |
| 3.4.1 野生株2936与缺失株JLUa2总RNA的抽提 | 第55-56页 |
| 3.4.2 lmbU对基因簇内部基因调节的多样性 | 第56-57页 |
| 3.5 林可链霉菌体内系统验证LmbU功能 | 第57-68页 |
| 3.5.1 体内实验线路流程 | 第57-58页 |
| 3.5.2 pIB139-neo~r的构建 | 第58-61页 |
| 3.5.3 pIB139-lmbWp-neo~r与pIB139-lmbVp-neo~r的构建 | 第61-65页 |
| 3.5.4 野生株2936和neo~r一次重组子对卡那霉素的敏感性测试 | 第65-66页 |
| 3.5.5 LmbU对lmbW和lmbV所属启动子的调控差异性 | 第66-68页 |
| 3.6 LmbU存在伴侣因子的体外证据 | 第68-78页 |
| 3.6.1 大肠杆菌双质粒系统的构建策略 | 第68-69页 |
| 3.6.2 pXG-lmbWp-GFP和pXG-lmbVp-GFP的构建 | 第69-74页 |
| 3.6.3 双质粒系统LmbU蛋白的表达检测 | 第74-75页 |
| 3.6.4 双质粒系统总RNA的抽提与半定量逆转录PCR(SqRT-PCR) | 第75-78页 |
| 第4章 讨论与展望 | 第78-88页 |
| 4.1 LmbU蛋白为潜在的DNA结合蛋白 | 第78-79页 |
| 4.2 lmbU基因缺失株与野生株的初级,次级代谢的差异分析 | 第79-80页 |
| 4.3 lmbU基因对林可霉素生物合成基因簇部分基因的影响 | 第80-82页 |
| 4.4 LmbU蛋白的DNA结合靶点 | 第82-84页 |
| 4.5 LmbU蛋白对LmbW和lmbV的转录调控差异性 | 第84页 |
| 4.6 LmbU存在伴侣蛋白的体内证据 | 第84-85页 |
| 4.7 本课题研究小结 | 第85-86页 |
| 4.8 课题展望 | 第86-88页 |
| 参考文献 | 第88-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
