| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 第一章 前言 | 第12-19页 |
| 1 大肠杆菌表达系统的组成 | 第12-14页 |
| 1.1 表达载体 | 第12-13页 |
| 1.1.1 启动子 | 第12-13页 |
| 1.1.2 SD序列 | 第13页 |
| 1.1.3 转录终止子 | 第13页 |
| 1.2 外源基因结构 | 第13页 |
| 1.3 表达宿主菌 | 第13-14页 |
| 2 大肠杆菌表达系统存在的一些问题 | 第14-15页 |
| 3 影响外源基因表达的因素 | 第15-16页 |
| 3.1 转录水平因素对外源基因表达的影响 | 第15页 |
| 3.2 翻译水平因素对外源基因表达的影响 | 第15-16页 |
| 4 密码子偏好性对蛋白表达的影响 | 第16-18页 |
| 4.1 密码子偏好性 | 第16-17页 |
| 4.2 稀有密码子对蛋白表达的影响 | 第17-18页 |
| 5 本研究的目的、意义及主要内容 | 第18-19页 |
| 第二章 材料与方法 | 第19-36页 |
| 1 焦磷酸酶的克隆表达及稀有密码子对其表达的影响 | 第19-26页 |
| 1.1 材料、仪器与试剂 | 第19-21页 |
| 1.1.1 实验材料 | 第19页 |
| 1.1.2 主要仪器 | 第19-20页 |
| 1.1.3 培养基和溶液 | 第20页 |
| 1.1.4 生化试剂 | 第20-21页 |
| 1.2 方法与步骤 | 第21-26页 |
| 1.2.1 引物设计 | 第21页 |
| 1.2.2 酵母基因组DNA的提取 | 第21-22页 |
| 1.2.3 稀有密码子系列无机焦磷酸酶基因扩增 | 第22页 |
| 1.2.4 DNA产物纯化试剂盒纯化PCR产物 | 第22-23页 |
| 1.2.5 质粒的提取 | 第23页 |
| 1.2.6 质粒pET-28a(+)和目的片段的双酶切 | 第23-24页 |
| 1.2.7 普通DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段 | 第24页 |
| 1.2.8 原核表达载体pET-28a(+)与目的片段连接 | 第24页 |
| 1.2.9 大肠杆菌DH5α化转感受态细胞的制备 | 第24-25页 |
| 1.2.10 连接产物的转化 | 第25页 |
| 1.2.11 阳性克隆子的筛选与鉴定 | 第25页 |
| 1.2.12 重组质粒转化至表达宿主菌 | 第25页 |
| 1.2.13 表达蛋白的SDS-PAGE分析 | 第25-26页 |
| 2 定点突变筛选不同密码子调控元件下调蛋白表达 | 第26-30页 |
| 2.1 材料、仪器与试剂 | 第26-27页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第26-27页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第27页 |
| 2.1.3 培养基和溶液 | 第27页 |
| 2.2 方法与步骤 | 第27-30页 |
| 2.2.1 突变位点的确定 | 第27-28页 |
| 2.2.2 突变方法 | 第28页 |
| 2.2.3 突变引物设计 | 第28-29页 |
| 2.2.4 PCR扩增质粒进行点突变 | 第29页 |
| 2.2.5 无机焦磷酸酶相对活性分析 | 第29-30页 |
| 3 密码子调控元件在不同位置以及不同表达系统对蛋白表达的影响 | 第30-31页 |
| 3.1 材料、仪器与试剂 | 第30页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第30页 |
| 3.1.2 主要仪器 | 第30页 |
| 3.1.3 培养基和溶液 | 第30页 |
| 3.2 方法与步骤 | 第30-31页 |
| 3.2.1 引物设计 | 第30-31页 |
| 3.2.2 稀有密码子系列无机焦磷酸酶基因扩增 | 第31页 |
| 4 密码子调控元件在不同蛋白及代谢途经改造上的应用 | 第31-36页 |
| 4.1 材料、仪器与试剂 | 第31-32页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第31-32页 |
| 4.1.2 主要仪器 | 第32页 |
| 4.1.3 培养基和溶液 | 第32页 |
| 4.2 方法与步骤 | 第32-36页 |
| 4.2.1 引物设计 | 第32-33页 |
| 4.2.2 细菌基因组DNA的提取 | 第33页 |
| 4.2.3 β-葡萄糖苷酶的扩增 | 第33-34页 |
| 4.2.4 β-葡萄糖苷酶的相对活性测定 | 第34页 |
| 4.2.5 IspG的扩增 | 第34-35页 |
| 4.2.6 Neurosporene产量检测方法 | 第35-36页 |
| 第三章 结果与分析 | 第36-61页 |
| 1 不同数量的稀有密码子R(精氨酸)对蛋白表达的影响 | 第36-39页 |
| 1.1 不同数量R系列无机焦磷酸酶(PPA)基因的扩增 | 第36页 |
| 1.2 R密码子系列无机焦磷酸酶原核表达载体的构建 | 第36-37页 |
| 1.3 稀有密码子对无机焦磷酸酶蛋白表达的影响 | 第37-38页 |
| 1.4 R密码子系列无机焦磷酸酶在Rosetta(DE3)中进行表达 | 第38-39页 |
| 2 利用DPN Ⅰ定点突变法获得不同的密码子调控元件 | 第39-43页 |
| 2.1 定点突变无机焦磷酸酶基因的扩增及测序鉴定 | 第39页 |
| 2.2 不同的密码子调控元件对无机焦磷酸酶蛋白表达的影响 | 第39-41页 |
| 2.3 不同的密码子调控元件下无机焦磷酸酶的相对活性分析 | 第41-43页 |
| 2.3.1 无机焦磷酸酶反应初速率时间范围的确定 | 第41页 |
| 2.3.2 无机焦磷酸酶的相对活性分析 | 第41-42页 |
| 2.3.3 不同的密码子调控元件载体在Rosetta中蛋白表达 | 第42-43页 |
| 3 不同位置密码子对无机焦磷酸酶表达的影响 | 第43-46页 |
| 3.1 密码子系列无机焦磷酸酶原核表达载体的构建 | 第44页 |
| 3.2 pET-21a(+)密码子系列无机焦磷酸酶的表达分析 | 第44-46页 |
| 4 PBAD表达系统下密码子调控元件对无机焦磷酸酶表达的影响 | 第46-50页 |
| 4.1 pBAD系统下不同密码子系列无机焦磷酸酶的扩增 | 第46-47页 |
| 4.2 pBAD系统下不同密码子系列无机焦磷酸酶原核表达载体的构建 | 第47-48页 |
| 4.3 pBAD表达系统下不同密码子无机焦磷酸酶的表达分析 | 第48-49页 |
| 4.4 pBAD表达系统下不同密码子无机焦磷酸酶的相对活性分析 | 第49-50页 |
| 5 不同的蛋白(B-葡萄糖苷酶)在密码子调控元件下的表达情况 | 第50-55页 |
| 5.1 不同密码子系列β-葡萄糖苷酶PCR扩增 | 第50页 |
| 5.2 不同密码子系列β-葡萄糖苷酶原核表达载体的构建 | 第50-51页 |
| 5.3 不同密码子调控元件下β-葡萄糖苷酶表达分析 | 第51-54页 |
| 5.4 不同密码子调控元件下β-葡萄糖苷酶相对活性分析 | 第54-55页 |
| 6 密码子调控元件在代谢途径改造上的应用 | 第55-58页 |
| 6.1 不同密码子系列IspG的PCR扩增 | 第55-56页 |
| 6.2 不同密码子系列IspG原核表达载体的构建 | 第56页 |
| 6.3 不同表达水平IspG对MEP途径的影响 | 第56-58页 |
| 7 讨论 | 第58-61页 |
| 第四章 本研究的主要结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-71页 |
| 附录1 部分试剂药品配方 | 第71-73页 |
| 附录2 缩略词 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
