| 摘要 | 第10-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 常用中英文缩略词表 | 第15-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-31页 |
| 1 前言 | 第16-17页 |
| 2 母源效应基因 | 第17-23页 |
| 2.1 母源效应基因的定义 | 第17页 |
| 2.2 母源效应基因的发现 | 第17-18页 |
| 2.3 母源效应基因的作用 | 第18-21页 |
| 2.3.1 雌雄原核的融合 | 第19-20页 |
| 2.3.2 染色质重塑 | 第20页 |
| 2.3.3 胚胎基因组激活 | 第20-21页 |
| 2.4 母源效应基因的表达调控 | 第21-23页 |
| 2.4.1 卵子发生中母源因子的产生 | 第22页 |
| 2.4.2 早期胚胎中母源因子的降解 | 第22-23页 |
| 3 候选母源效应基因PADI6的研究进展 | 第23-26页 |
| 3.1 PAD基因家族的生物学特性 | 第23-24页 |
| 3.2 PADI6基因的生物学功能 | 第24-25页 |
| 3.3 PAD基因家族的转录调控 | 第25-26页 |
| 4 启动子的结构和功能的研究 | 第26-29页 |
| 4.1 核心启动子 | 第26-27页 |
| 4.2 转录因子 | 第27-28页 |
| 4.3 研究方法 | 第28-29页 |
| 5 MicroRNA对母源效应基因的调控 | 第29-30页 |
| 6 目的与意义 | 第30-31页 |
| 第二章 材料和方法 | 第31-64页 |
| 1 实验材料 | 第31-36页 |
| 1.1 实验样品 | 第31页 |
| 1.2 细胞系 | 第31页 |
| 1.3 载体 | 第31-32页 |
| 1.4 主要仪器和设备 | 第32-33页 |
| 1.5 主要试剂与试剂盒 | 第33-34页 |
| 1.6 常用试剂及配制 | 第34-35页 |
| 1.7 主要的生物学软件和网站 | 第35-36页 |
| 2 实验方法 | 第36-64页 |
| 2.1 猪PADI6基因的克隆与生物信息学分析 | 第36-40页 |
| 2.1.1 普通PCR产物的扩增 | 第37页 |
| 2.1.2 RACE扩增cDNA末端 | 第37-39页 |
| 2.1.3 PCR产物的回收纯化和克隆测序 | 第39页 |
| 2.1.4 基因序列的生物信息学分析 | 第39-40页 |
| 2.2 猪PADI6基因表达模式分析 | 第40-45页 |
| 2.2.1 总RNA的提取 | 第40-41页 |
| 2.2.2 cDNA的合成 | 第41-42页 |
| 2.2.3 猪母源效应基因PADI6、MATER和NPM2的组织表达谱分析 | 第42-43页 |
| 2.2.4 卵母细胞的体外成熟培养 | 第43-44页 |
| 2.2.5 猪孤雌激活胚胎的培养和收集 | 第44页 |
| 2.2.6 猪体外受精胚胎的培养和收集 | 第44页 |
| 2.2.7 猪母源效应基因PADI6、MATER和NPM2在附植前胚胎中的表达模式 | 第44-45页 |
| 2.2.8 猪PADI6基因在不同发育阶段卵巢中的表达模式 | 第45页 |
| 2.3 猪PADI6基因超表达实验 | 第45-48页 |
| 2.3.1 猪PADI6基因全长CDS的克隆和超表达载体的构建 | 第45-46页 |
| 2.3.2 猪PADI6基因的瞬时转染实验 | 第46-47页 |
| 2.3.3 超表达实验的实时定量RT-PCR分析 | 第47-48页 |
| 2.3.4 超表达PADI6基因对细胞周期的分析 | 第48页 |
| 2.4 猪PADI6基因核心启动子区的鉴定 | 第48-52页 |
| 2.4.1 5’端上游调控区域序列的克隆与测序 | 第48-49页 |
| 2.4.2 5’端上游调控区域不同长度缺失片段的获取 | 第49-50页 |
| 2.4.3 启动子缺失片段pGL3荧光载体的构建 | 第50-51页 |
| 2.4.4 启动子片段双荧光素酶活性检测 | 第51-52页 |
| 2.4.5 核心启动子区的精细定位 | 第52页 |
| 2.5 猪PADI6基因核心启动子区转录因子结合位点的鉴定 | 第52-59页 |
| 2.5.1 核心启动子区转录因子的预测及分析 | 第52-53页 |
| 2.5.2 转录因子结合位点突变载体构建 | 第53页 |
| 2.5.3 EMSA | 第53-56页 |
| 2.5.4 ChIP | 第56-59页 |
| 2.6 转录因子对PADI6基因的调控 | 第59-61页 |
| 2.6.1 转录因子超表达实验 | 第59页 |
| 2.6.2 转录因子的RNA干扰实验 | 第59-60页 |
| 2.6.3 Western blot | 第60-61页 |
| 2.6.4 光辉霉素Mithramycin A处理细胞实验 | 第61页 |
| 2.7 Micro RNA对PADI6基因的表达调控 | 第61-64页 |
| 2.7.1 PADI6基因 3’UTR pmirGLO载体及其突变载体的构建 | 第61-63页 |
| 2.7.2 MiRNA mimics、inhibitor与pmirGLO载体共转染 | 第63页 |
| 2.7.3 MiRNA mimics、inhibitor对PADI6表达的影响 | 第63-64页 |
| 第三章 结果与分析 | 第64-103页 |
| 1 猪PADI6基因的克隆与生物信息学分析 | 第64-72页 |
| 1.1 猪PADI6基因CDS序列的克隆结果 | 第64页 |
| 1.2 猪PADI6基因cDNA末端的克隆结果 | 第64-65页 |
| 1.3 猪PADI6基因转录起始位点的确定 | 第65-66页 |
| 1.4 猪PADI6基因序列特征分析 | 第66-69页 |
| 1.5 猪PADI6基因生物信息学分析结果 | 第69-72页 |
| 2 猪PADI6基因表达模式分析 | 第72-78页 |
| 2.1 猪母源效应基因PADI6、MATER和NPM2的组织表达谱分析 | 第72-75页 |
| 2.1.1 组织RNA的提取结果分析 | 第72-73页 |
| 2.1.2 反转录cDNA检测结果 | 第73页 |
| 2.1.3 猪母源效应基因PADI6、MATER和NPM2在猪不同组织中的表达结果 | 第73-75页 |
| 2.2 猪母源效应基因PADI6、MATER和NPM2在附植前胚胎中的表达模式 | 第75-77页 |
| 2.2.1 猪PADI6、MATER和NPM2在孤雌激活胚胎中的表达 | 第75-76页 |
| 2.2.2 猪PADI6、MATER和NPM2在体外受精胚胎中的表达 | 第76-77页 |
| 2.3 猪PADI6基因在不同发育阶段卵巢中的表达模式 | 第77-78页 |
| 3 猪PADI6基因超表达实验 | 第78-82页 |
| 3.1 猪PADI6基因全长CDS的克隆和超表达载体的构建 | 第78-79页 |
| 3.2 重组质粒pcDNA3.1-PADI6瞬时转染细胞实验 | 第79页 |
| 3.3 猪PADI6基因超表达效果的定量分析 | 第79-80页 |
| 3.4 超表达PADI6基因后对相关基因表达的影响 | 第80-81页 |
| 3.5 超表达PADI6基因后对细胞周期的影响 | 第81-82页 |
| 4 猪PADI6基因转录调控机制的研究 | 第82-98页 |
| 4.1 猪PADI6基因 5’端上游调控区域的克隆与缺失载体的构建 | 第82-83页 |
| 4.2 猪PADI6基因启动子缺失片段在不同细胞系中的活性分析 | 第83-84页 |
| 4.3 猪PADI6基因核心启动子的精细定位 | 第84-86页 |
| 4.4 猪PADI6基因核心启动子区域的生物信息学分析 | 第86-87页 |
| 4.5 核心启动子区Sp1结合位点的定点突变验证 | 第87-88页 |
| 4.6 EMSA体外实验验证转录因子Sp1与预测位点的结合情况 | 第88-89页 |
| 4.7 ChIP体内实验验证转录因子与预测位点的结合情况 | 第89-90页 |
| 4.8 转录因子Sp1对PADI6基因的调控作用 | 第90-93页 |
| 4.8.1 超表达转录因子Sp1对PADI6基因的影响 | 第90-92页 |
| 4.8.2 干扰转录因子Sp1对PADI6基因的影响 | 第92-93页 |
| 4.9 转录因子Sp3对PADI6基因的调控作用 | 第93-96页 |
| 4.9.1 超表达转录因子Sp3对PADI6基因的影响 | 第93-94页 |
| 4.9.2 干扰转录因子Sp3对PADI6基因的影响 | 第94-96页 |
| 4.10 光辉霉素Mithramycin A对PADI6基因启动子活性的影响 | 第96-97页 |
| 4.11 转录因子Sp1和Sp3在不同发育阶段卵巢中的表达模式 | 第97-98页 |
| 5 Micro RNA对PADI6基因的表达调控 | 第98-103页 |
| 5.1 PADI6基因 3’UTR靶miRNA的预测及 3’UTR荧光载体的构建 | 第98页 |
| 5.2 PADI6基因 3’UTR靶miRNA的验证 | 第98-100页 |
| 5.3 通过定点突变来验证miR-320在PADI6基因 3’UTR的结合位点 | 第100-101页 |
| 5.4 miR-320对PADI6基因的表达调控 | 第101-103页 |
| 第四章 讨论 | 第103-111页 |
| 1 关于猪PADI6基因序列的分析 | 第103-104页 |
| 2 关于猪PADI6基因表达模式的分析 | 第104-105页 |
| 3 关于猪PADI6超表达实验分析 | 第105-107页 |
| 4 关于PADI6基因转录调控机制的分析 | 第107-110页 |
| 4.1 核心启动子区的鉴定 | 第107-108页 |
| 4.2 Sp1转录因子结合位点的鉴定 | 第108-109页 |
| 4.3 关于Sp1和Sp3对PADI6基因影响的分析 | 第109-110页 |
| 5 关于microRNA对PADI6基因的表达调控 | 第110-111页 |
| 第五章 结论 | 第111-113页 |
| 1 本研究得到的结论 | 第111-112页 |
| 2 下一步的工作计划 | 第112-113页 |
| 参考文献 | 第113-125页 |
| 附录 | 第125-128页 |
| 1 不同发育时期卵母细胞和早期胚胎 | 第125-126页 |
| 2 早期胚胎DAPI染色 | 第126-127页 |
| 3 猪PADI6基因 5’端调控序列 | 第127-128页 |
| 在读期间发表论文列表 | 第128-129页 |
| 致谢 | 第129-130页 |
