| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 综述 | 第13-34页 |
| 1.1 引言 | 第13-14页 |
| 1.2 研究背景 | 第14-19页 |
| 1.2.1 肝素/HS的结构和生物学功能 | 第14-16页 |
| 1.2.2 肝素/HS的合成研究 | 第16页 |
| 1.2.3 酶化学法对Heparosan进行硫酸化修饰 | 第16-18页 |
| 1.2.4 融合蛋白的构建和表达 | 第18-19页 |
| 1.3 3-O硫酸基转移酶 3OST-1 | 第19-21页 |
| 1.3.1 3OST的克隆 | 第19-20页 |
| 1.3.2 3OST的底物特异性 | 第20页 |
| 1.3.3 3OST的生物学功能 | 第20-21页 |
| 1.4 Heparosan硫酸化衍生物的作用 | 第21-25页 |
| 1.4.1 对炎症因子的作用 | 第21-22页 |
| 1.4.2 抗凝血作用 | 第22-23页 |
| 1.4.3 抗病毒作用 | 第23-25页 |
| 1.5 大肠杆菌K5发酵的研究进展 | 第25页 |
| 1.6 本课题研究内容和创新点 | 第25-27页 |
| 1.6.1 研究内容 | 第25-26页 |
| 1.6.2 创新点 | 第26-27页 |
| 参考文献 | 第27-34页 |
| 第二章 3-O硫酸基转移酶基因 3OST-1 的克隆及序列分析 | 第34-49页 |
| 2.1 前言 | 第34页 |
| 2.2 实验材料 | 第34-37页 |
| 2.2.1 菌种和质粒 | 第34-35页 |
| 2.2.2 组织标本 | 第35页 |
| 2.2.3 培养基与缓冲液 | 第35-36页 |
| 2.2.4 实验仪器 | 第36页 |
| 2.2.5 实验试剂、工具酶及试剂盒 | 第36-37页 |
| 2.3 实验方法 | 第37-43页 |
| 2.3.1 引物设计 | 第37-38页 |
| 2.3.2 大鼠大脑组织总RNA提取 | 第38页 |
| 2.3.3 总RNA浓度测定 | 第38-39页 |
| 2.3.4 RT-PCR扩增大鼠 3OST-1 cDNA | 第39-40页 |
| 2.3.5 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物及目的条带的切胶回收 | 第40页 |
| 2.3.6 重组质粒pMD19-T-3OST-1 的构建 | 第40-41页 |
| 2.3.7 E. coli TB1感受态细胞的制备 | 第41页 |
| 2.3.8 重组质粒pMD19-T-3OST-1 的转化 | 第41-42页 |
| 2.3.9 阳性单菌落的筛选 | 第42页 |
| 2.3.10 菌落PCR验证 | 第42-43页 |
| 2.3.11 重组质粒的提取 | 第43页 |
| 2.3.12 目的基因的测序及序列分析 | 第43页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第43-47页 |
| 2.4.1 总RNA的提取和 3OST-1 基因的PCR扩增 | 第43-44页 |
| 2.4.2 目的基因 3OST-1 的克隆 | 第44-46页 |
| 2.4.3 目的基因 3OST-1 的序列分析 | 第46-47页 |
| 2.5 小结 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-49页 |
| 第三章 3-O硫酸基转移酶 3OST-1 的表达和纯化 | 第49-69页 |
| 3.1 前言 | 第49-50页 |
| 3.2 实验材料 | 第50-54页 |
| 3.2.1 菌种和质粒 | 第50-51页 |
| 3.2.2 培养基与缓冲液 | 第51-52页 |
| 3.2.3 实验仪器 | 第52页 |
| 3.2.4 实验试剂、工具酶及试剂盒 | 第52-54页 |
| 3.3 实验方法 | 第54-60页 |
| 3.3.1 质粒的提取 | 第54页 |
| 3.3.2 双酶切反应 | 第54-55页 |
| 3.3.3 目的条带的切胶回收 | 第55页 |
| 3.3.4 重组表达载体pET-28a-3OST-1 的构建 | 第55页 |
| 3.3.5 E. coli BL21（DE3）感受态细胞的制备 | 第55页 |
| 3.3.6 重组质粒pET-28a-3OST-1 的转化 | 第55-56页 |
| 3.3.7 阳性克隆的筛选与鉴定 | 第56页 |
| 3.3.8 重组菌E. coli BL21/pET-28a-3OST-1 的诱导表达 | 第56页 |
| 3.3.9 表达产物SDS-PAGE分析 | 第56-58页 |
| 3.3.10 融合蛋白 3OST-1 的纯化和结果分析 | 第58页 |
| 3.3.11 Bradford法蛋白浓度的测定 | 第58-59页 |
| 3.3.12 融合蛋白 3OST-1 的酶活检测 | 第59-60页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第60-67页 |
| 3.4.1 重组质粒pMD19-T-3OST-1 和质粒pET-28a的双酶切反应 | 第60-61页 |
| 3.4.2 目的片段的切胶回收 | 第61-62页 |
| 3.4.3 重组质粒pET-28a-3OST-1 的构建 | 第62页 |
| 3.4.4 重组菌E. coli BL21/pET-28a-3OST-1 的筛选和鉴定 | 第62-65页 |
| 3.4.5 重组菌E. coli BL21/pET-28a-3OST-1 的诱导表达和纯化 | 第65页 |
| 3.4.6 融合蛋白 3OST-1 的分子量分析 | 第65-66页 |
| 3.4.7 融合蛋白 3OST-1 的酶活检测 | 第66-67页 |
| 3.5 小结 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-69页 |
| 第四章 3-O硫酸基转移酶 3OST-1 的应用 | 第69-84页 |
| 4.1 前言 | 第69页 |
| 4.2 实验材料 | 第69-72页 |
| 4.2.1 菌种 | 第69-70页 |
| 4.2.2 培养基与缓冲液 | 第70页 |
| 4.2.3 实验仪器 | 第70-71页 |
| 4.2.4 实验试剂 | 第71-72页 |
| 4.3 实验方法 | 第72-74页 |
| 4.3.1 Heparosan的过柱纯化 | 第72-73页 |
| 4.3.2 Heparosan的检测方法 | 第73页 |
| 4.3.3 NSNAH的化学法制备 | 第73页 |
| 4.3.4 3OST-1 对NSNAH的硫酸化修饰 | 第73-74页 |
| 4.3.5 NSNA3SHp对乙肝病毒的作用 | 第74页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第74-82页 |
| 4.4.1 Heparosan的纯化和检测 | 第74-76页 |
| 4.4.2 NSNAH的制备和检测 | 第76-77页 |
| 4.4.3 NSNA3SHp的制备和检测 | 第77-79页 |
| 4.4.4 NSNA3SHp对乙肝病毒作用的检测 | 第79-82页 |
| 4.5 小结 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-84页 |
| 第五章 结论与展望 | 第84-86页 |
| 5.1 结论 | 第84-85页 |
| 5.2 展望 | 第85-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第87页 |
