| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7页 |
| 第一章 绪论 | 第12-38页 |
| 1.1 引言 | 第12页 |
| 1.2 线粒体疾病的研究进展 | 第12-17页 |
| 1.3 Alpers综合征的研究进展 | 第17-23页 |
| 1.4 丙戊酸(VPA)引发肝毒性的研究进展 | 第23-26页 |
| 1.5 线粒体疾病的治疗研究进展 | 第26-29页 |
| 1.6 人诱导多能干细胞疾病模型研究进展 | 第29-33页 |
| 1.6.1 诱导多能干细胞 | 第29页 |
| 1.6.2 遗传疾病模型及机制研究 | 第29-33页 |
| 1.7 肝细胞体外分化的研究 | 第33-38页 |
| 第二章 实验方法与实验步骤 | 第38-62页 |
| 2.1 AHS病人iPSCs细胞的诱导 | 第38-39页 |
| 2.1.1 AHS病人细胞的获得和培养 | 第38页 |
| 2.1.2 AHS iPSCs细胞的诱导 | 第38-39页 |
| 2.2 AHS-iPSCs细胞的扩大培养与日常维持 | 第39-40页 |
| 2.3 AHS-iPSCs细胞的鉴定 | 第40-44页 |
| 2.3.1 突变类型以及核型的确认 | 第40页 |
| 2.3.2 碱性磷酸酶染色鉴定 | 第40-41页 |
| 2.3.3 免疫荧光染色 | 第41页 |
| 2.3.4 实时定量PCR方法鉴定内源性和外源多能性基因的表达 | 第41-42页 |
| 2.3.5 启动子去甲基化鉴定 | 第42-44页 |
| 2.3.6 AHS iPSCs细胞体外自发分化成拟胚体及鉴定 | 第44页 |
| 2.3.7 畸胎瘤分析 | 第44页 |
| 2.4 AHS iPSCs细胞体外肝分化 | 第44-47页 |
| 2.4.1 AHS iPSCs体外肝分化方法 | 第44-45页 |
| 2.4.2 AHS iPSCs来源的肝细胞的鉴定 | 第45-47页 |
| 2.5 AHS iPSCs-Hep线粒体功能相关指标检测 | 第47-57页 |
| 2.5.1 AHS iPSCs-Hep线粒体形态的电镜观察 | 第47-48页 |
| 2.5.2 AHS iPSCs-Hep线粒体形态的激光共聚焦显微镜观察 | 第48页 |
| 2.5.3 AHS iPSCs-Hep细胞ATP的检测 | 第48-49页 |
| 2.5.4 AHS iPSCs-Hep线粒体复合物Ⅳ的功能的检测 | 第49页 |
| 2.5.5 AHS iPSCs-Hep线粒体DNA含量的检测 | 第49-50页 |
| 2.5.6 Western检测AHS iPSCs-Hep线粒体DNA聚合酶POLG表达量 | 第50-52页 |
| 2.5.7 Western检测VPA处理和未处理的细胞的凋亡相关蛋白的表达情况 | 第52页 |
| 2.5.8 Western检测VPA处理和未处理的细胞的细胞色素c的表达情况 | 第52-53页 |
| 2.5.9 Western检测AHS iPSCs-Hep OPA1(optic atrophy 1)复合物与溶解的OPA | 第53页 |
| 2.5.10 AHS iPSCs-Hep乳酸和丙酮酸含量的检测 | 第53-54页 |
| 2.5.11 AHS iPSCs-Hep细胞活性氧ROS检测 | 第54-55页 |
| 2.5.12 AHS iPSCs-Hep谷胱甘肽含量的检测 | 第55页 |
| 2.5.13 质谱法检测AHS iPSCs-Hep细胞中VPA代谢产物4-ene-VPA | 第55-56页 |
| 2.5.14 AHS iPSCs-Hep细胞线粒体超氧炫的检测 | 第56页 |
| 2.5.15 AHS iPSCs-Hep细胞线粒体mPTP孔道检测 | 第56-57页 |
| 2.6 药物处理AHS iPSCs-Hep以及凋亡检测 | 第57-58页 |
| 2.6.1 VPA处理分化的AHS iPSCs-Hep | 第57页 |
| 2.6.2 N-乙酰半胱氨酸(NAC),乙酰胆碱(Carnitine)处理分化的AHS iPSCs-Hep | 第57页 |
| 2.6.3 环孢素CsA等抗氧化剂处理分化的AHS iPSCs-Hep | 第57-58页 |
| 2.7 分子克隆,肝细胞过表达线粒体DNA聚合酶POLG | 第58-62页 |
| 2.7.1 PCR扩增人POLG基因 | 第58-59页 |
| 2.7.2 POLG片段和pRLenti载体的酶切 | 第59-60页 |
| 2.7.3 酶切后的产物连接、转化、涂板、摇菌、大提质粒 | 第60页 |
| 2.7.4 pRLenti-POLG慢病毒的包装 | 第60-61页 |
| 2.7.5 感染分化的AHS iPSCs-Hep | 第61-62页 |
| 第三章 实验结果与实验数据 | 第62-88页 |
| 3.1 Alpers病人来源的诱导多能干细胞的获得与鉴定 | 第62-68页 |
| 3.1.1 Alpers综合征病人成纤维细胞的获得以及培养 | 第62页 |
| 3.1.2 AHS iPSCs的诱导 | 第62-63页 |
| 3.1.3 AHS iPSCs的鉴定 | 第63-68页 |
| 3.2 Alpers病人来源的体外诱导分化的肝细胞的获得与鉴定 | 第68-72页 |
| 3.2.1 AHS iPSCs体外定向分化为肝细胞样细胞 | 第68-69页 |
| 3.2.2 AHS iPSCs分化过程中表达各个阶段特异性标志物 | 第69页 |
| 3.2.3 AHS iPSCs-Hep表达肝细胞特征性基因 | 第69-71页 |
| 3.2.4 AHS iPSCs-Hep具有肝脏特征性功能 | 第71-72页 |
| 3.3 AHS iPSCs-Hep在体外培养过程加入丙戊酸(VPA)处理时更容易凋亡 | 第72页 |
| 3.4 VPA导致AHS iPSCs-Hep的凋亡是通过线粒体途径的 | 第72-75页 |
| 3.4.1 线粒体凋亡途径的凋亡蛋白Caspase 9和Caspase 3蛋白发生剪切 | 第73页 |
| 3.4.2 细胞色素c的释放 | 第73-74页 |
| 3.4.3 线粒体内膜上OPA1复合体组成异常 | 第74-75页 |
| 3.5 AHS iPSCs-Hep线粒体形态与功能存在缺陷 | 第75-79页 |
| 3.5.1 电镜显示AHS iPSCs-Hep线粒体形态异常 | 第75-76页 |
| 3.5.2 AHS iPSCs-Hep核基因POLG突变仍然存在 | 第76页 |
| 3.5.3 AHS iPSCs-Hep线粒体DNA聚合酶表达情况 | 第76-77页 |
| 3.5.4 AHS iPSCs-Hep线粒体DNA的含量变化 | 第77-78页 |
| 3.5.5 AHS iPSCs-Hep产生ATP的功能异常 | 第78-79页 |
| 3.6 线粒体通透转运孔道(mitochondrial permeability transitionpore,mPTP)的开放产生的超氧炫(superoxide flashes)在AHS iPSCs-Hep线粒体中更加频繁 | 第79-82页 |
| 3.6.1 AHS iPSCs-Hep线粒体中的活性氧(ROS)水平研究 | 第79页 |
| 3.6.2 AHS iPSCs-Hep线粒体中发生超氧炫更加频繁 | 第79-81页 |
| 3.6.3 AHS iPSCs-Hep线粒体通透转运孔道(mPTP)开放频率大于Ctrl iPSCs-Hep和H1 ESCs-Hep | 第81-82页 |
| 3.7 mPTP的抑制剂可以缓解AHS iPSCs-Hep对VPA引起的凋亡的敏感性 | 第82-85页 |
| 3.7.1 普通抑制活性氧(ROS)的抑制剂不能缓解AHS iPSCs-Hep对VPA引起的凋亡的敏性 | 第83页 |
| 3.7.2 mPTP的抑制剂可以缓解AHS iPSCs-Hep对VPA引起的凋亡的敏感性 | 第83-84页 |
| 3.7.3 AHS iPSCs-Hep线粒体中可能组成mPTP的复合物的组成和功能变化 | 第84-85页 |
| 3.8 传统药物乙酰胆碱(carnitine)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以缓解AHSiPSCs-Hep对VPA引起的凋亡的敏感性 | 第85-88页 |
| 3.8.1 carintine对于VPA代谢产物4-ene-VPA的影响 | 第85-86页 |
| 3.8.2 NAC对于细胞中谷胱甘肽(GSH)的影响 | 第86-87页 |
| 3.8.3 传统药物乙酰胆碱(carnitine)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以缓解AHS iPSCs-Hep对VPA引起的凋亡的敏感性 | 第87-88页 |
| 第四章 讨论 | 第88-91页 |
| 参考文献 | 第91-106页 |
| 附录一 实验材料与试剂 | 第106-108页 |
| 1. 实验动物 | 第106页 |
| 2. 实验仪器及耗材 | 第106页 |
| 3. 实验试剂 | 第106-108页 |
| 3.1 人胚胎干细胞以及iPSCs的培养和传代 | 第106页 |
| 3.2 AHS iPSCs诱导 | 第106页 |
| 3.3 iPSCs鉴定 | 第106-107页 |
| 3.4 肝分化 | 第107页 |
| 3.5 肝细胞鉴定 | 第107-108页 |
| 3.6 凋亡检测 | 第108页 |
| 3.7 分子克隆相关试剂 | 第108页 |
| 附录二 实验中使用的引物序列与抗体 | 第108-114页 |
| 致谢 | 第114-115页 |
| 在读期间取得的科研成果 | 第115页 |
