| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 符号说明 | 第9-14页 |
| 引言 | 第14-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-25页 |
| 1. 瘤胃甲烷排放及调控措施 | 第15-19页 |
| 1.1 瘤胃产甲烷菌 | 第15页 |
| 1.2 瘤胃甲烷产生途径 | 第15页 |
| 1.3 瘤胃甲烷减排的调控措施 | 第15-19页 |
| 1.3.1 调控日粮结构 | 第16页 |
| 1.3.2 添加有机酸 | 第16页 |
| 1.3.3 添加脂质 | 第16-17页 |
| 1.3.4 使用添加剂 | 第17页 |
| 1.3.5 免疫调控 | 第17-19页 |
| 2. 产甲烷重组蛋白疫苗 | 第19-21页 |
| 2.1 反向疫苗学 | 第19页 |
| 2.2 产甲烷菌广谱抗原基因的筛选 | 第19-20页 |
| 2.3 EhaF | 第20-21页 |
| 3. 高通量测序在瘤胃产甲烷菌研究上的应用 | 第21-24页 |
| 3.1 Roche GS FLX+system | 第22页 |
| 3.2 Ion Torrent PGM | 第22页 |
| 3.3 Miseq测序的Illumina | 第22-24页 |
| 4 存在的问题及本研究的目的意义 | 第24-25页 |
| 4.1 存在的问题 | 第24页 |
| 4.2 本研究的目的及意义 | 第24-25页 |
| 第二章：试验研究 | 第25-58页 |
| 试验一：重组蛋白的异源表达及纯化、鉴定 | 第25-39页 |
| 1. 材料 | 第25页 |
| 1.1 试验材料 | 第25页 |
| 1.1.1 目的基因：mru1407 | 第25页 |
| 1.1.2 菌株及载体 | 第25页 |
| 1.2 主要仪器和设备 | 第25页 |
| 1.3 生物信息软件 | 第25页 |
| 1.4 试剂 | 第25页 |
| 2. 试验方法 | 第25-31页 |
| 2.1 目的基因克隆及重组质粒的构建 | 第25-29页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第25-26页 |
| 2.1.2 PCR扩增目的基因 | 第26页 |
| 2.1.3 PCR产物回收 | 第26-27页 |
| 2.1.4 PCR产物及pET30a(+)双酶切 | 第27页 |
| 2.1.5 酶切产物胶回收及产物连接 | 第27-28页 |
| 2.1.6 大肠杆菌Top10感受态的制备 | 第28-29页 |
| 2.1.7 连接产物转化 | 第29页 |
| 2.1.8 阳性克隆鉴定 | 第29页 |
| 2.2 表达菌株的构建 | 第29-30页 |
| 2.2.1 大肠杆菌Rosetta感受态的制备 | 第29页 |
| 2.2.2 阳性克隆子及空载的转化及鉴定 | 第29-30页 |
| 2.3 重组质粒在ROSETTA的表达 | 第30-31页 |
| 2.3.1 小规模重组质粒表达 | 第30页 |
| 2.3.2 重组蛋白EhaF的纯化 | 第30页 |
| 2.3.3 重组蛋白SDS-PAGE条带的质谱分析 | 第30-31页 |
| 2.3.4 大规模重组质粒表达 | 第31页 |
| 3. 结果 | 第31-37页 |
| 3.1 重组质粒的构建 | 第31-32页 |
| 3.2 重组质粒PET30A(+)·MRU1407的表达 | 第32-35页 |
| 3.3 重组蛋白的纯化及鉴定 | 第35-37页 |
| 4. 讨论 | 第37-38页 |
| 4.1 表达载体的构建及蛋白的表达 | 第37-38页 |
| 4.2 蛋白的纯化及鉴定 | 第38页 |
| 5. 小结 | 第38-39页 |
| 试验二：重组蛋白EhaF免疫山羊及免疫效果评价 | 第39-58页 |
| 1. 材料 | 第39-40页 |
| 1.1 试验材料 | 第39页 |
| 1.1.1 重组蛋白EhaF | 第39页 |
| 1.1.2 试验动物 | 第39页 |
| 1.2 试验日粮 | 第39页 |
| 1.3 主要仪器和设备 | 第39-40页 |
| 1.4 试剂 | 第40页 |
| 1.5 生物信息学分析软件及数据库 | 第40页 |
| 2. 方法 | 第40-45页 |
| 2.1 重组蛋白EhaF免疫山羊 | 第40-41页 |
| 2.1.1 试验准备 | 第40页 |
| 2.1.2 免疫程序及采样时间 | 第40页 |
| 2.1.3 样品采集方法 | 第40-41页 |
| 2.2 抗体滴度检测 | 第41-42页 |
| 2.3 甲烷排放量检测 | 第42页 |
| 2.4 提取瘤胃微生物总DNA | 第42-43页 |
| 2.5 Miseq测序 | 第43-44页 |
| 2.6 数据分析 | 第44-45页 |
| 3. 结果 | 第45-53页 |
| 3.1 血液指标 | 第45-46页 |
| 3.2 清、唾液及瘤胃液抗体滴度 | 第46-47页 |
| 3.3 甲烷排放量 | 第47-48页 |
| 3.4 Miseq测序 | 第48-53页 |
| 3.4.1 稀释曲线 | 第48-49页 |
| 3.4.2 物种注释 | 第49-52页 |
| 3.4.3 Alpha多样性 | 第52-53页 |
| 3.4.4 产甲烷菌属丰度的比对 | 第53页 |
| 4. 讨论 | 第53-57页 |
| 4.1 血液生化指标及血常规 | 第53-54页 |
| 4.2 血清、唾液瘤胃液抗体滴度 | 第54-55页 |
| 4.3 甲烷排放量 | 第55页 |
| 4.4 稀释曲线 | 第55页 |
| 4.5 物种注释 | 第55-56页 |
| 4.6 Alpha多样性 | 第56-57页 |
| 4.7 产甲烷菌丰度的对比 | 第57页 |
| 5. 小结 | 第57-58页 |
| 第三章：结论及创新点 | 第58-59页 |
| 1. 结论 | 第58页 |
| 2. 创新点 | 第58页 |
| 3. 需进一步研究的问题 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-66页 |
| 致谢 | 第66页 |