| 摘要 | 第13-15页 |
| Abstract | 第15-17页 |
| 1 前言 | 第18-35页 |
| 1.1 葡萄根瘤蚜的危害 | 第18页 |
| 1.2 敏感葡萄对根瘤蚜侵染的响应 | 第18-20页 |
| 1.2.1 根瘤蚜侵染对敏感葡萄组织结构的影响 | 第18-19页 |
| 1.2.2 敏感葡萄对根瘤蚜侵染的生理生化响应 | 第19-20页 |
| 1.2.3 敏感葡萄在根瘤蚜侵染过程中的分子响应 | 第20页 |
| 1.3 抗性砧木对根瘤蚜侵害的防御反应 | 第20-22页 |
| 1.3.1 抗性砧木组织结构特性 | 第20-21页 |
| 1.3.2 抗性砧木的生理及分子响应 | 第21-22页 |
| 1.4 植物WRKY转录因子家族基因的发现和分布 | 第22-24页 |
| 1.5 WRKY转录因子基因的起源及在植物中的进化 | 第24页 |
| 1.6 WRKY转录因子参与植物对生物胁迫的抗性反应 | 第24-29页 |
| 1.6.1 植物WRKY对病原微生物的抗性防御反应 | 第26-29页 |
| 1.6.2 植物WRKY调节寄主与植物寄生害虫间的互作反应 | 第29页 |
| 1.7 WRKY在植物抗病害防御反应中的作用 | 第29-34页 |
| 1.7.1 WRKY参与植物抗逆分子信号转导 | 第30-32页 |
| 1.7.1.1 WRKY调控植物SA信号途径 | 第30-32页 |
| 1.7.1.2 WRKY参与植物MAPK信号级联反应 | 第32页 |
| 1.7.2 WRKY调节植物次生代谢物合成 | 第32-34页 |
| 1.8 研究的目的和意义 | 第34-35页 |
| 2 材料与方法 | 第35-59页 |
| 2.1 材料 | 第35-41页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第35页 |
| 2.1.2 葡萄根瘤蚜 | 第35页 |
| 2.1.3 菌株 | 第35-36页 |
| 2.1.4 载体 | 第36页 |
| 2.1.5 酶、抗生素、及各种生物化学试剂 | 第36-37页 |
| 2.1.6 仪器设备和耗材 | 第37页 |
| 2.1.7 引物合成和序列测定 | 第37页 |
| 2.1.8 培养基 | 第37-39页 |
| 2.1.9 PNS营养液成分 | 第39-40页 |
| 2.1.10 抗生素及其它试剂的配制 | 第40页 |
| 2.1.11 溶液和缓冲液配制 | 第40-41页 |
| 2.2 实验方法 | 第41-59页 |
| 2.2.1 葡萄WRKY基因家族成员的鉴定和生物信息学分析 | 第41-42页 |
| 2.2.1.1 葡萄WRKY基因家族成员的鉴定 | 第41-42页 |
| 2.2.1.2 葡萄WRKY基因家族成员的生物信息学分析 | 第42页 |
| 2.2.2 根瘤蚜培养和接种 | 第42-43页 |
| 2.2.2.1 根瘤蚜室内培养 | 第42页 |
| 2.2.2.2 根瘤蚜接种 | 第42-43页 |
| 2.2.3 葡萄扦插苗和组培苗培养 | 第43页 |
| 2.2.3.1 葡萄扦插苗 | 第43页 |
| 2.2.3.2 葡萄组培苗培养 | 第43页 |
| 2.2.4 葡萄各组织总RNA提取—CTAB法 | 第43-44页 |
| 2.2.5 葡萄总DNA提取—CTAB法 | 第44-45页 |
| 2.2.6 反转录cDNA第一链的合成 | 第45-46页 |
| 2.2.7 引物设计 | 第46页 |
| 2.2.8 半定量RT-PCR和实时定量PCR | 第46-47页 |
| 2.2.8.1 半定量RT-PCR | 第46页 |
| 2.2.8.2 qRT-PCR | 第46-47页 |
| 2.2.9 cDNA末端快速扩增 | 第47-49页 |
| 2.2.9.1 5'Race | 第47-49页 |
| 2.2.9.2 3'Race | 第49页 |
| 2.2.10 基因克隆 | 第49页 |
| 2.2.11 琼脂糖凝胶中DNA的回收 | 第49-50页 |
| 2.2.12 克隆载体构建 | 第50页 |
| 2.2.13 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第50-51页 |
| 2.2.13.1 感受态细胞的制备 | 第50-51页 |
| 2.2.13.2 感受态细胞的转化 | 第51页 |
| 2.2.14 根癌农杆菌（LBA4404和GV3101）感受态细胞的制备与转化 | 第51-52页 |
| 2.2.14.1 农杆菌感受态细胞的制备 | 第51-52页 |
| 2.2.14.2 农杆菌感受态细胞的转化—冻融热击法 | 第52页 |
| 2.2.15 菌落PCR检测阳性菌落 | 第52页 |
| 2.2.16 质粒DNA的提取 | 第52-53页 |
| 2.2.17 质粒DNA的酶切—快速酶切 | 第53页 |
| 2.2.18 表达载体的构建 | 第53-55页 |
| 2.2.18.1 GFP融合蛋白表达载体的构建 | 第53-54页 |
| 2.2.18.2 GUS表达载体的构建 | 第54页 |
| 2.2.18.3 过表达载体的构建 | 第54-55页 |
| 2.2.19 农杆菌介导的洋葱内表皮细胞的亚细胞定位 | 第55页 |
| 2.2.20 农杆菌介导的瞬时同源转录激活 | 第55-56页 |
| 2.2.21 葡萄胚性愈伤的转化 | 第56页 |
| 2.2.22 酵母单杂交试验 | 第56-59页 |
| 2.2.22.1 酵母感受态细胞的制备—Y187 | 第56-57页 |
| 2.2.22.2 载体pHis2转化 | 第57页 |
| 2.2.22.3 筛选抑制HIS本底表达的 3-AT浓度 | 第57页 |
| 2.2.22.4 互作验证 | 第57-59页 |
| 3 结果与分析 | 第59-96页 |
| 3.1 葡萄（Vitis vinifera L.）WRKY家族成员的鉴定和生物信息学分析 | 第59-69页 |
| 3.1.1 葡萄（Vitis vinifera L.）包含63个WRKY基因 | 第59-62页 |
| 3.1.2 葡萄WRKY蛋白系统进化关系分析和分类 | 第62-63页 |
| 3.1.3 葡萄WRKY的染色体定位及亚细胞定位预测 | 第63-64页 |
| 3.1.4 葡萄WRKY蛋白保守域和基因结构分析 | 第64-69页 |
| 3.2 葡萄WRKY基因在发育果实中的组织表达特性 | 第69-72页 |
| 3.2.1 VvWRKY在葡萄发育果实各组织中的表达 | 第70-71页 |
| 3.2.2 抗病相关PR基因在发育的葡萄果实中的表达 | 第71-72页 |
| 3.3 根瘤蚜刺吸影响敏感型品种克瑞森根系VvWRKY基因的表达 | 第72-75页 |
| 3.3.1 克瑞森根系VvWRKY基因响应根瘤蚜刺吸侵害 | 第72-74页 |
| 3.3.2 荧光定量PCR进一步验证试验结果 | 第74-75页 |
| 3.4 根瘤蚜刺吸影响中抗砧木品种 1103P根系VvWRKY基因的表达 | 第75-77页 |
| 3.4.1 1103P根系VvWRKYs基因的表达变化 | 第75-76页 |
| 3.4.2 接种方法验证 | 第76-77页 |
| 3.5 启动子响应验证 | 第77页 |
| 3.5.1 启动子克隆 | 第77页 |
| 3.5.2 同源转基因验证 | 第77页 |
| 3.6 根结形成过程中VvWRKYs基因在Crimson Seedless和 1103P根系中的表达变化 | 第77-79页 |
| 3.7 VvWRKYs基因在不同敏感型葡萄中的组织表达特异性 | 第79-80页 |
| 3.8 葡萄-根瘤蚜互作与植物内源激素SA和JA的关系 | 第80-85页 |
| 3.8.1 根瘤蚜刺吸对葡萄SA和JA信号途径相关基因表达量的影响 | 第80-82页 |
| 3.8.2 根结形成过程中SA相关基因的表达变化 | 第82-83页 |
| 3.8.3 外源植物激素SA和JA对根瘤蚜成活率的影响 | 第83-84页 |
| 3.8.4 根瘤蚜刺吸影响 1103P根系SA含量 | 第84页 |
| 3.8.5 SA相关基因启动子序列分析 | 第84-85页 |
| 3.9 VvWRKY40-1 和VvWRKY46基因的克隆 | 第85-86页 |
| 3.9.1 VvWRKY40-1 和VvWRKY46基因Race全长 | 第85-86页 |
| 3.9.2 VvWRKY40-1 和VvWRKY46基因全长克隆 | 第86页 |
| 3.10 VvWRKY40-1 和VvWRKY46的亚细胞定位 | 第86-87页 |
| 3.11 VvWRKY40-1 和VvWRKY46蛋白具有转录激活活性 | 第87-92页 |
| 3.11.1 葡萄叶片同源转录激活验证 | 第87-90页 |
| 3.11.2 酵母单杂交转录激活验证 | 第90-92页 |
| 3.12 VvWRKY40-1 和VvWRKY46蛋白与VvCHI1B、VvCHI1B1、Vv G1基因启动子互作验证 | 第92-96页 |
| 3.12.1 体外验证试验 | 第93-95页 |
| 3.12.2 VvWRKY40-1 和VvWRKY46蛋白分别与VvCHI1B基因启动子互作 | 第95-96页 |
| 4 讨论 | 第96-102页 |
| 4.1 根瘤蚜侵害改变葡萄WRKY基因转录本 | 第96-97页 |
| 4.2 WRKY转录因子正/负调节植物防御反应 | 第97-98页 |
| 4.3 WRKY调控SA信号途径参与葡萄-根瘤蚜之间的互作 | 第98-99页 |
| 4.4 植物PR基因的抗虫作用 | 第99-100页 |
| 4.5 WRKY调节植物PR基因的表达 | 第100-102页 |
| 5 结论 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-124页 |
| 附录 | 第124-132页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第132-133页 |
| 致谢 | 第133-134页 |
