| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 前言 | 第11-22页 |
| 1、诺如病毒基本特征 | 第11-15页 |
| 1.1 诺如病毒的分子生物学特征 | 第11-14页 |
| 1.2 诺如病毒的流行病学 | 第14-15页 |
| 2、诺如病毒的检测方法 | 第15-17页 |
| 2.1 诺如病毒颗粒检测方法 | 第15-16页 |
| 2.2 诺如病毒核酸检测方法 | 第16-17页 |
| 2.3 诺如病毒蛋白质检测方法 | 第17页 |
| 3、诺如病毒蛋白体外表达技术 | 第17-18页 |
| 3.1 诺如病毒衣壳蛋白杆状表达系统 | 第17-18页 |
| 3.2 诺如病毒衣壳蛋白原核表达系统 | 第18页 |
| 4、诺如病毒的动物模型与体外培养 | 第18-20页 |
| 5、本论文研究内容与意义 | 第20-22页 |
| 一、实验材料 | 第22-32页 |
| 1、实验动物及病毒株 | 第22页 |
| 2、主要试剂及试剂盒 | 第22-26页 |
| 3、主要溶液的配制 | 第26-30页 |
| 3.1 蛋白表达所用溶液 | 第26页 |
| 3.2 琼脂糖电泳所用溶液 | 第26-27页 |
| 3.3 Western blot所用溶液 | 第27-28页 |
| 3.4 ELISA所用溶液 | 第28-29页 |
| 3.5 猴源肠上皮细胞培养基 | 第29-30页 |
| 4、主要仪器设备 | 第30-31页 |
| 5、抗体 | 第31-32页 |
| 二、实验方法 | 第32-56页 |
| 1、粪便样本中诺如病毒的检测 | 第32-39页 |
| 1.1 粪便样本的采集、制备 | 第32页 |
| 1.2 粪便样本中RNA提取 | 第32-33页 |
| 1.3 TaqMan荧光定量RT-PCR方法定量检测粪便样本中诺如病毒含量 | 第33-39页 |
| 2、诺如病毒全基因组扩增及序列分析 | 第39-40页 |
| 2.1 诺如病毒阳性样品的筛选 | 第39页 |
| 2.2 一株猴源GⅡ.17型诺如病毒全基因组序列扩增 | 第39-40页 |
| 2.3 三株人源GⅡ.4型诺如病毒全基因组序列扩增 | 第40页 |
| 3、GⅡ.17基因型诺如病毒P结构域及其变体蛋白的原核表达 | 第40-52页 |
| 3.1 重组质粒P-RGD-GST、P△R-GST的构建 | 第40-45页 |
| 3.2 重组融合蛋白的表达、纯化及鉴定 | 第45-49页 |
| 3.3 不含载体的目的蛋白的纯化及鉴定 | 第49-50页 |
| 3.4 目的蛋白的抗血清制备及ELISA检测效价 | 第50-52页 |
| 4、诺如病毒自然感染猕猴模型的初步建立 | 第52-53页 |
| 4.1 诺如病毒自然感染猕猴模型的构建 | 第52页 |
| 4.2 感染后猕猴临床表现观察及样本采集 | 第52页 |
| 4.3 感染后猕猴粪便中诺如病毒含量检测 | 第52页 |
| 4.4 感染后猕猴血清中诺如病毒抗体滴度检测 | 第52-53页 |
| 5、猕猴唾液与诺如病毒P结构域及变体蛋白的结合 | 第53-54页 |
| 5.1 猕猴唾液样本分型 | 第53-54页 |
| 5.2 GⅡ.17型诺如病毒与唾液中HBGAs结合分析 | 第54页 |
| 6、诺如病毒体外细胞培养的初步探索 | 第54-56页 |
| 6.1 猕猴结肠上皮细胞分离培养 | 第54-56页 |
| 三、实验结果 | 第56-79页 |
| 1、粪便样本中诺如病毒含量测定结果 | 第56-60页 |
| 2、诺如病毒全基因组序列分析结果 | 第60-68页 |
| 2.1 一株猴源GⅡ.17型诺如病毒全基因组序列分析 | 第60-66页 |
| 2.2 三株人源GⅡ.4型诺如病毒全基因组序列分析 | 第66-68页 |
| 3、GⅡ.17基因型诺如病毒P结构域及其变体的原核表达与鉴定 | 第68-73页 |
| 3.1 重组质粒P-RGD-GST、P△R-GST的构建 | 第68-69页 |
| 3.2 重组融合蛋白P-RGD-GST、P△R-GST的原核表达 | 第69-70页 |
| 3.3 重组融合蛋白P-RGD-GST、P△R-GST的纯化和鉴定 | 第70-71页 |
| 3.4 目的蛋白P-RGD、P△R的纯度和鉴定 | 第71-72页 |
| 3.5 蛋白浓度的测定 | 第72页 |
| 3.6 目的蛋白P-RGD、P△R抗血清的制备及ELISA检测效价 | 第72-73页 |
| 4、诺如病毒自然感染猕猴模型的初步建立 | 第73-75页 |
| 4.1 感染后猕猴临床表现观察与分析 | 第73页 |
| 4.2 感染后猕猴粪便中诺如病毒含量 | 第73-74页 |
| 4.3 感染后猕猴血清中诺如病毒抗体滴度 | 第74-75页 |
| 5、猕猴唾液与诺如病毒P结构域及变体蛋白的结合 | 第75-77页 |
| 5.1 猕猴唾液表型分布测定 | 第75-76页 |
| 5.2 诺如病毒与猕猴唾液中HBGAs结合情况 | 第76-77页 |
| 6、诺如病毒体外细胞培养的初步探索 | 第77-79页 |
| 6.1 永生化猴源肠上皮细胞的分离培养 | 第77-79页 |
| 四、讨论 | 第79-81页 |
| 五、结论 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-86页 |
| 附录 | 第86-106页 |
| 附录1. 三株人源GⅡ.4基因型诺如病毒全基因组序列 | 第86-98页 |
| 1.1、人源2057全基因组序列 | 第86-90页 |
| 1.2、人源2060全基因组序列 | 第90-94页 |
| 1.3、人源2086全基因组序列 | 第94-98页 |
| 附录2. 原核表达纯化蛋白核苷酸序列及氨基酸序列 | 第98-104页 |
| 2.1、载体pGEX-4T-1含GST部分核苷酸序列 | 第98页 |
| 2.2、密码子未优化P结构域蛋白(P-RGD)核苷酸序列 | 第98-99页 |
| 2.3、密码子优化后P结构域(P-RGD)核苷酸序列 | 第99页 |
| 2.4、P结构域(P-RGD)氨基酸序列 | 第99-100页 |
| 2.5、P-RGD基因插入pGEX-4T-1载体后即P-RGD-GST核苷酸序列 | 第100-101页 |
| 2.6、密码子未优化P结构域变体蛋白(P△R)核苷酸序列 | 第101页 |
| 2.7、密码子优化后P结构域变体蛋白(P△R)核苷酸序列 | 第101-102页 |
| 2.8、P结构域变体蛋白(P△R)氨基酸序列 | 第102页 |
| 2.9、P△R基因插入pGEX-4T-1载体后即GST-P△R核苷酸序列 | 第102-104页 |
| 附录3. 缩略词表 | 第104-105页 |
| 附录4. BCA标准品稀释方法 | 第105-106页 |
| 研究生简历 | 第106-107页 |
| 致谢 | 第107-108页 |
