| 中文摘要 | 第1-16页 |
| ABSTRACT | 第16-20页 |
| 第一章 文献综述 | 第20-32页 |
| 1 Warburg效应与PKM2 | 第20-21页 |
| 2 PKM2概述 | 第21-30页 |
| ·PKM2的表达调控 | 第21-23页 |
| ·PKM的表达调节 | 第21-22页 |
| ·PKM基因的选择性剪接 | 第22-23页 |
| ·表观遗传及microRNA调控 | 第23页 |
| ·PKM2蛋白稳定性调控 | 第23页 |
| ·PKM2的活性调控 | 第23-25页 |
| ·代谢中间产物对PKM2的活性调控 | 第23-24页 |
| ·翻译后修饰对PKM2的活性调控 | 第24-25页 |
| ·PKM2对肿瘤代谢的调控 | 第25-27页 |
| ·PKM2对细胞信号通路的调控 | 第27-30页 |
| ·PKM2的临床应用 | 第30页 |
| 3 本课题的研究意义及研究内容 | 第30-32页 |
| 第二章 PKM1和PKM2不同活性突变体的稳定表达细胞株的建立 | 第32-47页 |
| 1 引言 | 第32页 |
| 2 材料与方法 | 第32-40页 |
| ·实验材料 | 第32-34页 |
| ·细胞、菌株与质粒 | 第32页 |
| ·试剂与抗体 | 第32-33页 |
| ·主要试剂配制方法 | 第33-34页 |
| ·主要仪器设备 | 第34页 |
| ·实验方法 | 第34-40页 |
| ·细胞培养 | 第34页 |
| ·细胞的冻存与复苏 | 第34-35页 |
| ·RNA提取、反转录cDNA | 第35-36页 |
| ·PKM1、PKM2慢病毒表达载体的构建 | 第36-37页 |
| ·PKM2不同点突变慢病毒载体K367M、R399E和K433E的构建 | 第37-38页 |
| ·稳定敲低PKM慢病毒载体的构建 | 第38-39页 |
| ·慢病毒包装 | 第39页 |
| ·DLD1细胞株转染和筛选 | 第39-40页 |
| ·荧光定量PCR和western blot鉴定稳定细胞株 | 第40页 |
| 3 结果 | 第40-46页 |
| ·稳定敲低PKM的结肠癌细胞株的获得及检测 | 第40-42页 |
| ·稳定过表达PKM1、PKM2的结肠癌细胞株的获得及检测 | 第42-44页 |
| ·PKM2不同活性突变体的稳定过表达细胞株的获得及检测 | 第44-46页 |
| 4 讨论 | 第46-47页 |
| 第三章 PKM2过表达影响结肠癌细胞迁移与粘附的分子机制 | 第47-67页 |
| 1 引言 | 第47页 |
| 2 材料与方法 | 第47-52页 |
| ·实验材料 | 第47-49页 |
| ·细胞、菌株与质粒 | 第47页 |
| ·试剂与抗体 | 第47-48页 |
| ·主要试剂配制方法 | 第48页 |
| ·主要仪器设备 | 第48-49页 |
| ·实验方法 | 第49-52页 |
| ·细胞培养 | 第49页 |
| ·实时定量PCR分析 | 第49-50页 |
| ·细胞浆蛋白、核蛋白抽提和western blot分析 | 第50页 |
| ·细胞划痕实验 | 第50-51页 |
| ·细胞基质粘附实验 | 第51页 |
| ·siRNA转染敲低STAT3 | 第51-52页 |
| ·丙酮酸激酶活性分析 | 第52页 |
| ·统计分析 | 第52页 |
| 3 结果 | 第52-64页 |
| ·敲低PKM抑制了结肠癌细胞的迁移 | 第52-53页 |
| ·敲低PKM抑制了结肠癌细胞与基质的粘附作用 | 第53页 |
| ·敲低PKM引起结肠癌细胞迁移与粘附变化的分子机制 | 第53-55页 |
| ·过表达PKM2能促进结肠癌细胞的迁移和粘附 | 第55-57页 |
| ·过表达PKM2逆转结肠癌细胞迁移、粘附相关的信号 | 第57-58页 |
| ·PKM2调控STAT3表达的机制 | 第58-60页 |
| ·PKM2通过调控STAT3表达来促进DLD1细胞迁移和细胞基质粘附 | 第60-62页 |
| ·PKM2促进结肠癌细胞迁移和粘附依赖其蛋白激酶活性 | 第62-64页 |
| 4 讨论 | 第64-67页 |
| 第四章 PKM2促进结肠癌细胞炎症因子分泌及增殖的分子机制 | 第67-88页 |
| 1 引言 | 第67页 |
| 2 材料与方法 | 第67-73页 |
| ·实验材料 | 第67-68页 |
| ·细胞 | 第67-68页 |
| ·试剂与抗体 | 第68页 |
| ·主要试剂配制方法 | 第68页 |
| ·实验方法 | 第68-73页 |
| ·细胞培养 | 第68页 |
| ·细胞浆蛋白、核蛋白抽提和western blot分析 | 第68页 |
| ·MTT法检测LPS对结肠癌细胞增殖的影响 | 第68-69页 |
| ·qPCR分析 | 第69页 |
| ·酶联免疫吸附实验(ELISA)检测TNF-α与IL-1β的分泌 | 第69页 |
| ·siRNA转染敲低STAT3 | 第69-70页 |
| ·免疫质免疫共沉淀(ChIP)分析 | 第70-73页 |
| ·丙酮酸激酶活性分析 | 第73页 |
| ·统计分析 | 第73页 |
| 3 结果 | 第73-85页 |
| ·LPS促进DLD1细胞TNF-α与IL-1β的表达与细胞增殖 | 第73-74页 |
| ·LPS诱导DLD1细胞中炎症因子的表达和代谢改变 | 第74-75页 |
| ·敲低PKM能逆转LPS引起的结肠癌细胞炎症因子的表达与增殖 | 第75-77页 |
| ·PKM2过表达促进LPS诱导的DLD1细胞炎症因子的表达与增殖 | 第77-79页 |
| ·NF-κB信号调控LPS诱导的PKM2的表达 | 第79页 |
| ·PKM2通过上调STAT3表达来调控TNF-α和IL-1β的表达 | 第79-81页 |
| ·ChIP检测PKM2结合STAT3启动子 | 第81-83页 |
| ·LPS同时诱导了胞内PKM2的丙酮酸激酶及蛋白激酶活性 | 第83-84页 |
| ·PKM2诱导的炎症因子分泌依赖其蛋白激酶活性 | 第84-85页 |
| 4 讨论 | 第85-88页 |
| 第五章 分泌型PKM2对结肠癌细胞迁移的影响及分子机制 | 第88-102页 |
| 1 引言 | 第88页 |
| 2 材料与方法 | 第88-93页 |
| ·实验材料 | 第88-89页 |
| ·细胞、菌株与质粒 | 第88页 |
| ·试剂与抗体 | 第88-89页 |
| ·主要试剂配制方法 | 第89页 |
| ·实验方法 | 第89-93页 |
| ·细胞培养及条件培养基的收集 | 第89-90页 |
| ·重组表达质粒pGEX-4T-1-PKM1和pGEX-4T-1-PKM2的构建 | 第90页 |
| ·重组蛋白GST-PKM1、GST-PKM2的表达与纯化 | 第90-91页 |
| ·细胞划痕法检测细胞迁移 | 第91页 |
| ·实时定量PCR检测mRNA变化 | 第91页 |
| ·Western blot检测蛋白变化 | 第91-92页 |
| ·瞬时转染敲低β-catenin、PKM2 | 第92页 |
| ·PI3K信号通路抑制剂LY294002对细胞迁移的影响 | 第92-93页 |
| ·统计学分析 | 第93页 |
| 3 结果 | 第93-100页 |
| ·结肠癌细胞系中分泌型PKM1、PKM2的检测 | 第93页 |
| ·重组表达质粒pGEX-4T-1-PKM1和pGEX-4T-1-PKM2的构建 | 第93-94页 |
| ·重组蛋白GST-PKM1、GST-PKM2的表达与纯化 | 第94-95页 |
| ·分泌型PKM2促进结肠癌DLD1细胞迁移 | 第95-96页 |
| ·敲低PKM2抑制PKM2的分泌及DLD1细胞的迁移 | 第96-97页 |
| ·分泌型PKM2活化p-catenin信号通路 | 第97-98页 |
| ·分泌型PKM2激活PI3K/Akt促进结肠癌细胞迁移 | 第98-100页 |
| 4 讨论 | 第100-102页 |
| 总结与展望 | 第102-104页 |
| 参考文献 | 第104-115页 |
| 个人简历及读博期间发表文章 | 第115-117页 |
| 致谢 | 第117-119页 |
| 承诺书 | 第119-120页 |
