灰树花多糖的FITC荧光标记及Caco-2细胞模型对其的吸收与转运研究

【摘要】：灰树花多糖(Grifolan,GRN)具有多种生物活性,主要包括抗肿瘤、增强机体免疫特别是细胞免疫,经常与临床化疗药物合用,在提高药效同时可降低药物的副作用。但是,国内均没有人对灰树花多糖的代谢动力学进行研究,其主要难点在于缺少高灵敏的灰树花多糖检测手段。我们拟对灰树花多糖进行荧光标记,并通过Caco-2细胞模型对其吸收与摄入展开研究,为GRN的药代动力深入研究提供帮助。首先,通过Sevag及分步沉淀等方法完成GRN初步纯化,再经DEAE-纤维素和Sephadex G-100凝胶柱层析纯化得到GRN纯品,经苯酚-硫酸法测定纯化后多糖含量为95.7%。其次,利用GRN末端的还原性与酪胺(Tyr)完成还原胺化反应,膜分离去除过剩Tyr等小分子,获得纯化的GRN-Tyr共价偶联物,再利用GRN-Tyr中Tyr的氨基基团与异硫氰酸荧光素(FITC)进行亲核反应,完成GRN荧光标记,最后通过Sephadex G-100柱层析获得纯化的GRN-Tyr-FITC。通过苯酚硫酸法跟踪检测每步反应的产物糖原含量;PAGE电泳比较各反应产物迁移率(Rx);紫外光谱扫描跟踪反应产物是Tyr280nm、FITC490nm的特征吸收峰;荧光光谱扫描合成后的GRN-Tyr-FITC最佳激发波长与发射波长。计算GRN-Tyr-FITC中FITC的取代度,并对其进行稳定性实验。结果表明GRN-Tyr、GRN-Tyr-FITC二次标记成功;GRN-Tyr-FITC可以荧光定量检测(Ex:490nm,Em:520nm),尽管其最佳激发波长、最佳发射波长均有细微红移;GRN-Tyr-FITC可在避光4°C条件下稳定保存30天;分批合成的GRN-Tyr-FITC取代度达0.039%~0.060%(W/W)。最后,选用Caco-2细胞Transwell单层培养模型,可快速模拟肠道吸收转运多糖能力。体外建立Caco-2细胞单层培养模型,并通过检测跨膜电阻(TEER)、显微形态观察及标志物渗漏方法保证其完整性和紧密性。将GRN-Tyr-FITC制成100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL六个浓度,添加到接种在Transwell上的Caco-2细胞中,以30min、60min、120min、180min、240min为检测点,评估Caco-2细胞在顶端侧(AP)到基底侧(BL)方向及基底侧(BL)到顶端侧(AP)方向的转运能力,实验结束后,再次检测细胞跨膜电阻并进行回收率实验,结果表明GRN-Tyr-FITC在AP侧可能存在主动转运机制,0-4h内Caco-2细胞对其的摄入量还没达到饱和,而在BL侧浓度600-1000μg/mLGRN-Tyr-FITC在180min后出现了饱和现象。TEER值与实验前相比变化不大,GRN-Tyr-FITC回收率为64.52%(W/W),回收液中的GRN-Tyr-FITC与对照组GRN-Tyr-FITC的PAGE电泳电泳迁移率相似。表明Caco-2细胞的摄入对GRN-Tyr-FITC的结构无影响,该荧光标记方法适用于对GRN类多糖的代谢动力学分析。
【关键词】：灰树花多糖 异硫氰酸荧光素 聚丙烯酰胺凝胶电泳 Caco-2细胞 细胞跨膜电阻 表观渗透系数
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R284;R285