| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-15页 |
| 第1章 引言 | 第15-40页 |
| ·TGF- 超家族信号通路概述 | 第15-18页 |
| ·信号传导方式 | 第15-16页 |
| ·TGF- 超家族通路配体 | 第16页 |
| ·TGF- 超家族通路受体 | 第16-18页 |
| ·Smad 家族蛋白 | 第18-24页 |
| ·Smad 家族蛋白的发现和结构域划分 | 第18-20页 |
| ·Smad 家族蛋白的结构 | 第20-24页 |
| ·TGF- 超家族信号通路在 Smad 蛋白层次上的调控 | 第24-33页 |
| ·I-Smad 负调控 TGF- 超家族信号通路 | 第25-26页 |
| ·泛素-蛋白酶体通路负调控 TGF- 超家族信号通路 | 第26-30页 |
| ·泛素化系统简介 | 第26-28页 |
| ·HECT 家族泛素 E3 连接酶泛素化降解 Smad 蛋白 | 第28-29页 |
| ·其它泛素 E3 连接酶泛素化降解 Smad 蛋白 | 第29-30页 |
| ·蛋白磷酸酶调控 TGF- 超家族信号通路 | 第30-32页 |
| ·R-Smad/Co-Smad 复合物的解离 | 第32-33页 |
| ·蛋白-蛋白相互作用调控 TGF- 超家族信号通路 | 第33页 |
| ·CHIP 蛋白 | 第33-38页 |
| ·CHIP 蛋白简介 | 第33-36页 |
| ·CHIP 蛋白的结构 | 第36页 |
| ·CHIP 蛋白的功能 | 第36-37页 |
| ·CHIP 负调控 TGF- 信号通路 | 第37-38页 |
| ·本研究的意义与技术路线 | 第38-40页 |
| 第2章 SMAD 和 CHIP 蛋白的制备 | 第40-62页 |
| ·引言 | 第40页 |
| ·材料与方法 | 第40-49页 |
| ·cDNA | 第40页 |
| ·载体 | 第40页 |
| ·菌种 | 第40-41页 |
| ·试剂 | 第41页 |
| ·蛋白纯化柱和柱材 | 第41-42页 |
| ·仪器 | 第42页 |
| ·大肠杆菌表达质粒的构建与筛选 | 第42-46页 |
| ·DNA 引物的设计 | 第42页 |
| ·PCR | 第42-43页 |
| ·DNA 片段的回收 | 第43页 |
| ·DNA 限制性内切酶酶切 | 第43-44页 |
| ·目的 DNA 片段与表达载体连接 | 第44页 |
| ·JM109 (DE3) 超级感受态细胞的制备 | 第44-45页 |
| ·连接产物转化 JM109 (DE3) 超级感受态细胞 | 第45页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第45页 |
| ·突变体的构建 | 第45-46页 |
| ·蛋白的表达与纯化方法 | 第46-49页 |
| ·BL21（DE3）感受态细胞的制备 | 第46-47页 |
| ·目的蛋白的表达 | 第47页 |
| ·重组表达蛋白的提取 | 第47页 |
| ·利用镍亲和层析柱纯化蛋白 | 第47-48页 |
| ·利用 GST 亲和层析柱纯化蛋白 | 第48页 |
| ·亲和柱上酶切去除亲和标签 | 第48页 |
| ·利用离子交换层析柱纯化蛋白 | 第48页 |
| ·浓缩蛋白 | 第48-49页 |
| ·利用分子筛层析柱纯化蛋白 | 第49页 |
| ·结果与讨论 | 第49-61页 |
| ·Smad 家族蛋白的表达与纯化 | 第49-58页 |
| ·Smad 家族全长蛋白的表达与纯化 | 第49-51页 |
| ·Smad1/2/3/4/5-MH1 的表达与纯化 | 第51-52页 |
| ·Smad1/5-MH2 的表达与纯化 | 第52-53页 |
| ·Smad2-MH2 的表达与纯化 | 第53-55页 |
| ·Smad1/2/4/5-L-MH2 的表达与纯化 | 第55-56页 |
| ·Smad3-L-MH2 的表达与纯化 | 第56页 |
| ·Smad6/7/8 的表达与纯化 | 第56-58页 |
| ·CHIP 蛋白的表达与纯化 | 第58-61页 |
| ·小结 | 第61-62页 |
| 第3章 CHIP 结合 SMAD1 碳末端尾巴 | 第62-76页 |
| ·引言 | 第62页 |
| ·材料与方法 | 第62-67页 |
| ·cDNA 和表达质粒 | 第62页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第62页 |
| ·分子筛层析方法研究蛋白-蛋白相互作用 | 第62-64页 |
| ·GST pulldown 方法研究蛋白-蛋白相互作用 | 第64页 |
| ·真核表达质粒的构建与筛选 | 第64页 |
| ·HEK293T 细胞的培养与传代 | 第64-65页 |
| ·免疫共沉淀方法研究蛋白-蛋白相互作用 | 第65页 |
| ·蛋白质印迹 (免疫印迹) | 第65-66页 |
| ·体外泛素化 | 第66-67页 |
| ·结果与讨论 | 第67-75页 |
| ·CHIP-TPR 负责结合 Smad1 | 第67-69页 |
| ·Smad1-MH2 负责结合 CHIP | 第69-70页 |
| ·Smad1 碳末端缺失突变体不结合 CHIP | 第70-73页 |
| ·CHIP 倾向于结合激活状态 Smad1 | 第73-74页 |
| ·CHIP 倾向于泛素化激活状态 Smad1 | 第74-75页 |
| ·小结 | 第75-76页 |
| 第4章 CHIP-SMAD1 复合物晶体结构的解析 | 第76-91页 |
| ·引言 | 第76页 |
| ·材料与方法 | 第76-81页 |
| ·Smad1 多肽 | 第76页 |
| ·结晶条件筛选试剂盒 | 第76页 |
| ·试剂 | 第76页 |
| ·仪器 | 第76-77页 |
| ·结晶样品制备 | 第77页 |
| ·晶体初步筛选 | 第77-78页 |
| ·晶体优化 | 第78-81页 |
| ·选择防冻液 | 第81页 |
| ·结果与讨论 | 第81-90页 |
| ·晶体的筛选与优化 | 第81-84页 |
| ·数据收集 | 第84页 |
| ·结构解析 | 第84页 |
| ·结构分析 | 第84-90页 |
| ·小结 | 第90-91页 |
| 第5章 分子伴侣抑制 CHIP 泛素化 SMAD177 | 第91-101页 |
| ·引言 | 第91页 |
| ·材料与方法 | 第91-93页 |
| ·质粒 | 第91页 |
| ·分子伴侣多肽 | 第91页 |
| ·仪器 | 第91页 |
| ·等温滴定量热方法研究蛋白-蛋白相互作用 | 第91-93页 |
| ·结果与讨论 | 第93-100页 |
| ·Hsp70/Hsc70-C 多肽与 CHIP-TPR 复合物晶体结构 | 第93-95页 |
| ·分子伴侣与 Smad1 竞争性结合 CHIP | 第95-99页 |
| ·分子伴侣抑制 CHIP 泛素化 Smad1 | 第99-100页 |
| ·小结 | 第100-101页 |
| 第6章 CHIP 特异性识别 SMAD1/587 | 第101-107页 |
| ·引言 | 第101页 |
| ·结果与讨论 | 第101-106页 |
| ·CHIP 结合 Smad5，不结合 Smad2、Smad3 和 Smad4 | 第101-103页 |
| ·疏水氨基酸残基提供识别特异性 | 第103-105页 |
| ·CHIP 破坏具有生物学活力的 R-/Co-Smad 复合体 | 第105-106页 |
| ·小结 | 第106-107页 |
| 第7章 其它相关研究工作 | 第107-118页 |
| ·CHIP 蛋白其它片段结构生物学研究 | 第107-110页 |
| ·Smad 蛋白相关蛋白磷酸酶研究 | 第110-116页 |
| ·Smad 蛋白磷酸酶之 SCP | 第110-113页 |
| ·Smad 蛋白磷酸酶之 PPM1A | 第113-114页 |
| ·Smad 蛋白磷酸酶之 PDP | 第114-116页 |
| ·小结 | 第116-118页 |
| 第8章 总结与展望 | 第118-122页 |
| ·总结 | 第118-120页 |
| ·展望 | 第120-122页 |
| 参考文献 | 第122-131页 |
| 致谢 | 第131-133页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第133页 |
