| 缩略词表 | 第1-9页 |
| 摘要 | 第9-16页 |
| ABSTRACT | 第16-25页 |
| 前言 | 第25-33页 |
| 1 S100蛋白家族 | 第25-27页 |
| 2 S100A1蛋白 | 第27-29页 |
| 3 S100B蛋白 | 第29-33页 |
| 研究思路 | 第33-34页 |
| 技术路线 | 第33-34页 |
| 第一部分 人源 S100A1 和 S100B 全基因合成和优化、表达、 纯化与鉴定 | 第34-60页 |
| 技术路线 | 第34-35页 |
| 实验一 人源S100A1 全基因合成和优化、表达、纯化与鉴定 | 第35-49页 |
| 1. 材料与方法 | 第35-44页 |
| ·实验材料 | 第35-36页 |
| ·质粒与菌株 | 第35页 |
| ·主要试剂 | 第35-36页 |
| ·主要仪器 | 第36页 |
| ·主要培养基及溶液配制 | 第36页 |
| ·主要实验方法 | 第36-44页 |
| ·感受态细菌的制备方法 | 第36-37页 |
| ·转化方法 | 第37页 |
| ·胶回收步骤 | 第37-38页 |
| ·质粒小量提取 | 第38页 |
| ·人源S100A1 序列的优化设计与引物合成 | 第38-39页 |
| ·PCR 合成优化后人源S100A1 序列 | 第39页 |
| ·克隆载体pMD18-S100A1 构建 | 第39-40页 |
| ·表达载体pBV220-S100A1 构建 | 第40页 |
| ·重组蛋白诱导表达 | 第40页 |
| ·重组蛋白鉴定 | 第40-42页 |
| ·SDS-PAGE 鉴定 | 第40-42页 |
| ·Western Blotting 鉴定 | 第42页 |
| ·重组S100A1 蛋白纯化 | 第42-43页 |
| ·重组S100A1 蛋白脱盐与冻干 | 第43-44页 |
| 2. 结果 | 第44-48页 |
| ·优化后人源S100A1 序列 | 第44页 |
| ·合成序列PCR 结果 | 第44页 |
| ·克隆载体pMD18-S100A1 鉴定 | 第44-45页 |
| ·人源S100A1 合成序列测序结果 | 第45页 |
| ·表达载体pBV220-S100A1 鉴定 | 第45-46页 |
| ·人源S100A1 蛋白诱导表达与表达形式分析 | 第46-47页 |
| ·重组S100A1 蛋白鉴定 | 第47-48页 |
| ·重组蛋白纯化 | 第48页 |
| 3. 小结 | 第48-49页 |
| 实验二人源S100B 全基因合成和优化、表达、纯化与鉴定 | 第49-60页 |
| 1. 材料与方法 | 第49-52页 |
| ·实验材料 | 第49页 |
| ·质粒与菌株 | 第49页 |
| ·主要试剂 | 第49页 |
| ·主要仪器 | 第49页 |
| ·主要实验方法 | 第49-52页 |
| ·感受态细菌的制备方法 | 第49页 |
| ·转化方法 | 第49页 |
| ·胶回收步骤 | 第49页 |
| ·质粒小量提取 | 第49-50页 |
| ·人源S100B 序列优化设计与引物合成 | 第50页 |
| ·PCR 合成优化后人源S100B 序列 | 第50-51页 |
| ·克隆载体pMD18-S100B 构建 | 第51页 |
| ·表达载体pET32a-S100B 构建 | 第51页 |
| ·重组蛋白诱导表达 | 第51页 |
| ·重组蛋白鉴定 | 第51页 |
| ·重组蛋白纯化 | 第51-52页 |
| ·重组S100B 蛋白脱盐与冻干 | 第52页 |
| 2. 结果 | 第52-57页 |
| ·优化后人源S100B 序列 | 第52页 |
| ·合成序列PCR 结果 | 第52-53页 |
| ·克隆载体pMD18-S100B 鉴定 | 第53-54页 |
| ·人源S100B 合成序列测序结果 | 第54页 |
| ·表达载体pET32a-S100B 鉴定 | 第54-55页 |
| ·人源S100B 蛋白诱导表达与表达形式分析 | 第55-56页 |
| ·重组S100B 蛋白鉴定 | 第56页 |
| ·重组蛋白纯化 | 第56-57页 |
| 3. 小结 | 第57页 |
| 4. 讨论 | 第57-60页 |
| 第二部分：人源S100A1和S100B 蛋白促Hela 细胞侵袭迁移研究 | 第60-69页 |
| 1 材料和方法 | 第60-64页 |
| ·实验材料 | 第60-61页 |
| ·实验细胞 | 第60页 |
| ·主要试剂 | 第60-61页 |
| ·主要仪器 | 第61页 |
| ·细胞培养用试剂 | 第61页 |
| ·主要实验方法 | 第61-64页 |
| ·Transwell 侵袭实验 | 第61-63页 |
| ·Transwell 迁移实验 | 第63页 |
| ·细胞冻存和复苏 | 第63-64页 |
| 2. 结果 | 第64-67页 |
| ·人源S100A1 蛋白Transwell 侵袭实验 | 第64页 |
| ·人源S100A1 蛋白Transwell 迁移实验 | 第64-65页 |
| ·人源S100B 蛋白Transwell 侵袭实验 | 第65-66页 |
| ·人源S100B 蛋白Transwell 迁移实验 | 第66-67页 |
| 3. 小结 | 第67页 |
| 4. 讨论 | 第67-69页 |
| 第三部分 单克隆抗体的制备及纯化 | 第69-94页 |
| 技术路线 | 第70-71页 |
| 实验一 抗人S100A1 单克隆抗体的制备及纯化 | 第71-86页 |
| 1. 材料与方法 | 第71-80页 |
| ·实验材料 | 第71-72页 |
| ·实验动物及细胞 | 第71页 |
| ·主要试剂 | 第71页 |
| ·主要仪器 | 第71-72页 |
| ·主要溶液配制 | 第72-74页 |
| ·抗体纯化相关试剂配制 | 第72页 |
| ·SDS-PAGE 相关溶液配制 | 第72-73页 |
| ·ELISA 相关溶液配制 | 第73页 |
| ·细胞培养用试剂配制 | 第73-74页 |
| ·主要实验方法 | 第74-80页 |
| ·动物免疫 | 第74页 |
| ·实验动物血清效价测定 | 第74-75页 |
| ·骨髓瘤细胞复苏和培养 | 第75页 |
| ·饲养层细胞制备 | 第75页 |
| ·脾淋巴细胞制备 | 第75-76页 |
| ·细胞融合 | 第76页 |
| ·阳性克隆筛选 | 第76页 |
| ·阳性克隆克隆化培养 | 第76-77页 |
| ·杂交瘤细胞冻存与复苏 | 第77页 |
| ·单克隆抗体特异性检测 | 第77页 |
| ·杂交瘤细胞分泌特异性抗体稳定性检测 | 第77页 |
| ·腹水制备 | 第77-78页 |
| ·腹水单克隆抗体纯化 | 第78页 |
| ·单克隆抗体蛋白浓度测定 | 第78-79页 |
| ·单克隆抗体亲和常数测定 | 第79-80页 |
| ·单克隆抗体保存 | 第80页 |
| 2 结果 | 第80-85页 |
| ·小鼠免疫结果 | 第80页 |
| ·细胞融合及阳性杂交瘤筛选 | 第80-81页 |
| ·腹水效价测定 | 第81页 |
| ·杂交瘤细胞分泌抗体稳定性测定结果 | 第81-82页 |
| ·单克隆抗体纯化结果鉴定及定量 | 第82页 |
| ·单克隆抗体特异性检测 | 第82-83页 |
| ·单克隆抗体亲和常数测定 | 第83-85页 |
| 3. 小结 | 第85-86页 |
| 实验二 抗人S100B 单克隆抗体的制备及纯化 | 第86-94页 |
| 1. 材料与方法 | 第86页 |
| 2 结果 | 第86-90页 |
| ·小鼠免疫结果 | 第86页 |
| ·细胞融合及阳性杂交瘤筛选 | 第86-87页 |
| ·腹水效价测定 | 第87页 |
| ·杂交瘤细胞分泌抗体稳定性测定结果 | 第87页 |
| ·单克隆抗体纯化结果鉴定及定量 | 第87-88页 |
| ·单克隆抗体特异性鉴定 | 第88-89页 |
| ·单克隆抗体亲和常数测定 | 第89-90页 |
| 3. 小结 | 第90页 |
| 4. 讨论 | 第90-94页 |
| 第四部分 抗人S100A1和S100B蛋白单克隆抗体的活性分析 | 第94-106页 |
| 1 材料与方法 | 第95-97页 |
| ·实验材料 | 第95页 |
| ·细胞 | 第95页 |
| ·主要试剂 | 第95页 |
| ·主要仪器 | 第95页 |
| ·主要实验方法 | 第95-97页 |
| ·细胞增殖检测 | 第95-96页 |
| ·细胞凋亡率检测 | 第96-97页 |
| ·细胞中蛋白表达检测 | 第97页 |
| ·细胞全蛋白制备 | 第97页 |
| ·统计分析 | 第97页 |
| 2. 结果 | 第97-101页 |
| ·抗人S100A1 单克隆抗体对A375 细胞增殖的影响 | 第97-98页 |
| ·抗人S100A1 单克隆抗体对A375 细胞凋亡的影响 | 第98-99页 |
| ·A375 细胞中S100A1 和P53 蛋白表达 | 第99-100页 |
| ·抗人S100B 单克隆抗体对A375 细胞增殖的影响 | 第100页 |
| ·抗人S100B 单克隆抗体对A375 细胞凋亡的影响 | 第100-101页 |
| ·A375 细胞中S100B 和P53 蛋白表达 | 第101页 |
| 3. 小结 | 第101-103页 |
| 4. 讨论 | 第103-106页 |
| 结论 | 第106-107页 |
| 参考文献 | 第107-116页 |
| 文献综述 | 第116-130页 |
| 参考文献 | 第122-130页 |
| 致谢 | 第130-131页 |
| 个人简介 | 第131页 |
| 在学期间参与课题、发表文章及获奖情况 | 第131-134页 |
| 质粒图谱 | 第134-136页 |
