| 摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-17页 |
| 主要英文缩写与译名 | 第17-18页 |
| 引言 | 第18-21页 |
| 第一章 文献综述 | 第21-63页 |
| 第一节 木聚糖的结构 | 第22-24页 |
| 第二节 木聚糖酶的分类 | 第24-26页 |
| 第三节 木聚糖酶的结构及其催化机理 | 第26-37页 |
| 1 木聚糖酶的晶体结构 | 第26-29页 |
| ·G/11家族木聚糖酶的晶体结构 | 第26-28页 |
| ·木聚糖酶分子的构象变化 | 第28-29页 |
| 2 木聚糖酶结构域 | 第29-35页 |
| ·木聚糖酶催化结构域 | 第30页 |
| ·木聚糖酶纤维素结合域 | 第30-32页 |
| ·木聚糖酶木聚糖结合域 | 第32页 |
| ·连接序列 | 第32-33页 |
| ·重复序列 | 第33页 |
| ·嗜酸/碱性相关氨基酸 | 第33-35页 |
| ·纤维小体锚定结构域 | 第35页 |
| 3 木聚糖酶催化机理 | 第35-37页 |
| 第四节 木聚糖酶的热稳定性 | 第37-43页 |
| 1 热稳定结构域 | 第39-40页 |
| 2 二硫键 | 第40页 |
| 3 离子键 | 第40-41页 |
| 4 芳香族氨基酸残基的作用 | 第41-42页 |
| 5 个别氨基酸在木聚糖酶热稳定性中的作用 | 第42-43页 |
| 第五节 木聚糖酶的分子进化 | 第43-48页 |
| 1 G/11家族木聚糖酶序列同源性 | 第43-44页 |
| 2 F/10家族木聚糖酶序列同源性 | 第44-45页 |
| 3 纤维素结合域的整合 | 第45-46页 |
| 4 Ca2+结合位点与进化 | 第46-47页 |
| 5 木聚糖酶的进化关系 | 第47-48页 |
| 第六节 木聚糖酶基因的克隆和表达 | 第48-56页 |
| 1 木聚糖酶基因在大肠杆菌中表达 | 第49-50页 |
| 2 木聚糖酶基因在酵母中表达 | 第50-55页 |
| ·外源基因本身的影响 | 第52-53页 |
| ·信号肽的选择 | 第53页 |
| ·外源基因拷贝数 | 第53-54页 |
| ·蛋白酶的水解和发酵工艺 | 第54-55页 |
| 3 木聚糖酶基因在植物中表达 | 第55页 |
| 4 木聚糖酶基因动物细胞和转基因动物中表达 | 第55-56页 |
| 第七节 木聚糖酶的应用研究 | 第56-63页 |
| 1 木聚糖酶在饲料工业中应用 | 第56-57页 |
| 2 木聚糖酶在造纸和制浆工业中应用 | 第57-58页 |
| 3 木聚糖酶在食品工业中应用 | 第58页 |
| 4 低聚木糖的研究进展 | 第58-63页 |
| ·低聚木糖的功能 | 第59-60页 |
| ·低聚木糖的制备 | 第60-61页 |
| ·低聚木糖的纯化 | 第61-63页 |
| 第二章 研究工作报告 | 第63-193页 |
| 第一节 杂合木聚糖酶基因atx的分子设计及其在大肠杆菌中的表达 | 第63-90页 |
| 前言 | 第63-65页 |
| 一、杂合木聚糖酶基因atx的分子设计和构建 | 第65-79页 |
| 1 杂合木聚糖酶基因atx的构建策略 | 第65-66页 |
| 2 试验材料 | 第66-67页 |
| 3 试验方法 | 第67-72页 |
| ·木聚糖酶基因片段的扩增和杂合基因构建 | 第67-68页 |
| ·平末端atx加A | 第68-69页 |
| ·DNA电泳 | 第69页 |
| ·目的片段割胶回收 | 第69-70页 |
| ·atx与T载体连接 | 第70页 |
| ·E.coli TOP10F’感受态细胞的制备与转化 | 第70-71页 |
| ·阳性克隆子的鉴定 | 第71-72页 |
| ·atx测序及分析 | 第72页 |
| 4 试验结果 | 第72-77页 |
| ·杂合木聚糖酶基因atx的分子设计 | 第72页 |
| ·木聚糖酶基因片段的TD-PCR扩增 | 第72-73页 |
| ·杂合木聚糖酶基因atx的构建 | 第73页 |
| ·阳性克隆子的筛选与鉴定 | 第73-74页 |
| ·杂合木聚糖酶基因atx的序列分析 | 第74-77页 |
| 5 讨论 | 第77-79页 |
| 二、杂合木聚糖酶基因atx在大肠杆菌中的表达 | 第79-90页 |
| 1 杂合木聚糖酶基因atx在大肠杆菌中的表达策略 | 第79-80页 |
| 2 试验材料 | 第80页 |
| 3 试验方法 | 第80-85页 |
| ·pBS-T atx vector的双酶切 | 第80-81页 |
| ·pET-30a(+)的双酶切 | 第81页 |
| ·连接 | 第81页 |
| ·E.coli BL21(DE3)感受态细胞的制备和转化 | 第81页 |
| ·阳性转化子的筛选 | 第81页 |
| ·阳性表达子的筛选 | 第81-82页 |
| ·试剂配制 | 第82-83页 |
| ·木聚糖酶活性测定 | 第83-84页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第84-85页 |
| 4 试验结果 | 第85-88页 |
| ·重组载体pBS-T atx vector双酶切 | 第85页 |
| ·pET-30a(+)的双酶切 | 第85页 |
| ·阳性转化子的筛选 | 第85-86页 |
| ·木聚糖酶活性测定 | 第86-87页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第87-88页 |
| 5 讨论 | 第88-90页 |
| 第二节 杂合木聚糖酶基因atx在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究 | 第90-125页 |
| 前言 | 第91-92页 |
| 一、杂合木聚糖酶基因atx在毕赤酵母中的表达 | 第92-109页 |
| 1 杂合木聚糖酶基因atx在毕赤酵母中的表达策略 | 第92-93页 |
| 2 试验材料 | 第93-94页 |
| 3 试验方法 | 第94-102页 |
| ·pPIC9K的提取和双酶切 | 第94-95页 |
| ·pPIC9K-atx质粒的构建 | 第95-96页 |
| ·E.coli TOP10F'感受态细胞的制备和转化 | 第96页 |
| ·阳性克隆子的筛选 | 第96页 |
| ·pPIC9K-atx质粒的大量提取 | 第96页 |
| ·pPIC9K-atx质粒的纯化 | 第96-97页 |
| ·pPIC9K-atx质粒线性化及纯化浓缩 | 第97-98页 |
| ·毕赤酵母GS115感受态细胞的制备 | 第98页 |
| ·电击转化 | 第98-99页 |
| ·酵母转化子的筛选和培养 | 第99页 |
| ·酵母阳性转化子的PCR鉴定 | 第99-101页 |
| ·酵母阳性表达子的筛选 | 第101-102页 |
| 4 试验结果 | 第102-107页 |
| ·pPIC9K-atx质粒的构建 | 第102页 |
| ·pPIC9K-atx质粒的提取和线性化 | 第102-103页 |
| ·电击转化和阳性转化子的筛选 | 第103-105页 |
| ·酵母阳性表达子的筛选 | 第105页 |
| ·亲本酶在毕赤酵母中的表达 | 第105-107页 |
| 5 讨论 | 第107-109页 |
| 二、杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶的酶学性质 | 第109-125页 |
| 1 试验材料 | 第109页 |
| 2 试验方法 | 第109-113页 |
| ·培养基配制 | 第109页 |
| ·酵母基因工程菌的培养 | 第109页 |
| ·系列缓冲液的配制 | 第109-110页 |
| ·木聚糖酶的纯化 | 第110-112页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第112页 |
| ·木聚糖酶活性测定 | 第112页 |
| ·木聚糖酶酶学性质分析 | 第112-113页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第113页 |
| 3 试验结果 | 第113-121页 |
| ·杂合木聚糖酶PATx的纯化 | 第113-114页 |
| ·pH对杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶活性的影响 | 第114-115页 |
| ·温度对杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶活性的影响 | 第115页 |
| ·杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶的pH稳定性 | 第115-116页 |
| ·杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶的热稳定性 | 第116-117页 |
| ·小麦木聚糖酶抑制剂对PATx及其亲本酶活性的影响 | 第117-118页 |
| ·杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶的SDS-PAGE分析 | 第118-121页 |
| 4 讨论 | 第121-125页 |
| 第三节 杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶水解特性的研究 | 第125-150页 |
| 前言 | 第126-127页 |
| 1 试验材料 | 第127页 |
| 2 试验方法 | 第127-128页 |
| ·木糖及低聚木糖标准品保留时间和浓度方程 | 第127页 |
| ·木聚糖水解产物的HPLC分析 | 第127页 |
| ·PATx及其重组亲本酶水解模式的分析 | 第127-128页 |
| 3 试验结果 | 第128-145页 |
| ·标准品保留时间和浓度方程 | 第128-129页 |
| ·PATX及其重组亲本酶水解桦木木聚糖产物的分析 | 第129-133页 |
| ·PATx及其亲本酶水解小麦麸皮不溶木聚糖产物分析 | 第133-137页 |
| ·PATx及其重组亲本酶的水解模式 | 第137-145页 |
| 4 讨论 | 第145-150页 |
| 第四节 PATx融合木聚糖结合域对其结合水解纤维素能力的影响 | 第150-193页 |
| 前言 | 第151-153页 |
| 一、杂合木聚糖酶基因atxx的分子设计和构建 | 第153-165页 |
| 1 杂合木聚糖酶基因atxx的构建策略 | 第153-154页 |
| 2 试验材料 | 第154-155页 |
| 3 试验方法 | 第155-158页 |
| ·基因片段的扩增和杂合木聚糖酶基因atxx的构建 | 第155-156页 |
| ·平末端atxx加A | 第156页 |
| ·DNA电泳 | 第156页 |
| ·目的片段割胶回收 | 第156页 |
| ·atxx与T载体连接 | 第156-157页 |
| ·E.coli TOP10F’感受态细胞的制备与转化 | 第157页 |
| ·阳性克隆子的鉴定 | 第157-158页 |
| ·atxx测序及分析 | 第158页 |
| 4 试验结果 | 第158-164页 |
| ·杂合木聚糖酶基因atxx的分子设计 | 第158-159页 |
| ·杂合木聚糖酶基因atxx的构建 | 第159-160页 |
| ·阳性克隆子的筛选与鉴定 | 第160页 |
| ·杂合木聚糖酶基因atxx序列分析 | 第160-164页 |
| 5 讨论 | 第164-165页 |
| 二、杂合木聚糖酶基因atxx在毕赤酵母中的表达 | 第165-174页 |
| 1 杂合木聚糖酶基因atxx在毕赤酵母中的表达策略 | 第165-166页 |
| 2 试验材料 | 第166页 |
| 3 试验方法 | 第166-170页 |
| ·pPIC9K载体双酶切 | 第166页 |
| ·pBS-T atxx vector双酶切 | 第166-167页 |
| ·pPIC9K-atxx的构建 | 第167页 |
| ·E.coli TOP10F'感受态细胞的制备和转化 | 第167页 |
| ·阳性克隆子的筛选 | 第167页 |
| ·pPIC9K-atxx的大量提取和纯化 | 第167页 |
| ·pPIC9K-atxx线性化及纯化浓缩 | 第167-168页 |
| ·毕赤酵母GS115感受态细胞制备 | 第168页 |
| ·电击转化 | 第168页 |
| ·酵母转化子的筛选和培养 | 第168页 |
| ·酵母阳性转化子的PCR鉴定 | 第168-170页 |
| ·酵母阳性表达子的筛选 | 第170页 |
| 4 试验结果 | 第170-174页 |
| ·pPIC9K-atxx的构建 | 第170-171页 |
| ·pPIC9K-atxx的大量提取和线性化 | 第171-172页 |
| ·电击转化和阳性转化子的筛选 | 第172-173页 |
| ·酵母阳性表达子的筛选 | 第173-174页 |
| 三、杂合木聚糖酶PATxX的酶学性质 | 第174-193页 |
| 1 试验材料 | 第174页 |
| 2 试验方法 | 第174-177页 |
| ·培养基配制 | 第174页 |
| ·酵母工程菌pPATxX1培养 | 第174页 |
| ·系列缓冲液的配制 | 第174页 |
| ·木聚糖酶的纯化 | 第174页 |
| ·木聚糖酶活性测定 | 第174-175页 |
| ·木聚糖酶酶学性质分析 | 第175页 |
| ·重组小麦木聚糖酶抑制剂对PATxX活性的影响 | 第175页 |
| ·PATxX的纤维素酶活性测定 | 第175-176页 |
| ·PATxX结合微晶纤维素测定 | 第176页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第176页 |
| ·PATxX水解木聚糖产物的HPLC分析 | 第176页 |
| ·PATxX水解模式分析 | 第176页 |
| ·AFM表征桦木木聚糖水解过程中结构变化 | 第176-177页 |
| 3 试验结果 | 第177-189页 |
| ·杂合木聚糖酶PATxX的纯化 | 第177页 |
| ·pH对PATxX木聚糖酶活性的影响 | 第177-178页 |
| ·温度对PATxX木聚糖酶活性的影响 | 第178页 |
| ·小麦木聚糖酶抑制剂对PATxX木聚糖酶活性的影响 | 第178-179页 |
| ·pH对PATxX纤维素酶活性的影响 | 第179页 |
| ·温度对PATxX纤维素酶活性的影响 | 第179-180页 |
| ·PATxX结合微晶纤维素能力的研究 | 第180页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第180-182页 |
| ·PATxX水解桦木木聚糖产物的分析 | 第182-183页 |
| ·PATxX水解小麦麸皮不溶木聚糖产物的分析 | 第183-187页 |
| ·杂合木聚糖酶PATxX的水解模式 | 第187页 |
| ·AFM表征桦木木聚糖水解过程中结构变化 | 第187-189页 |
| 4 讨论 | 第189-193页 |
| 第三章 小结、创新点和后续研究展望 | 第193-197页 |
| 1 小结 | 第193-195页 |
| 2 创新点 | 第195-196页 |
| 3 后续研究展望 | 第196-197页 |
| 参考文献 | 第197-218页 |
| 附录 | 第218-221页 |
| 攻读博士学位期间发表的主要论文 | 第221-222页 |
| 致谢 | 第222页 |
