| 独创性声明 | 第1-4页 |
| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第6-12页 |
| 1 引言 | 第12-22页 |
| 1．1 植物抗寒性的生理生化基础 | 第12-15页 |
| 1．1．1 膜系统与植物抗寒性的关系 | 第12-13页 |
| 1．1．2 活性氧与植物抗寒性的关系 | 第13-14页 |
| 1．1．3 低温诱导基因表达与植物抗寒性 | 第14-15页 |
| 1．2 植物抗寒基因工程 | 第15-17页 |
| 1．2．1 转基因提高膜脂不饱和度 | 第16页 |
| 1．2．2 转编码抗氧化酶基因 | 第16页 |
| 1．2．3 转低温诱导基因 | 第16-17页 |
| 1．3 抗冻蛋白及其遗传转化研究 | 第17-22页 |
| 1．3．1 动物抗冻蛋白 | 第17-18页 |
| 1．3．2 抗冻蛋白作用机理 | 第18-19页 |
| 1．3．3 植物抗冻蛋白研究 | 第19-20页 |
| 1．3．4 抗冻蛋白基因对植物的遗传转化 | 第20-22页 |
| 1．3．4．1 动物抗冻蛋白基因转化植物 | 第20-21页 |
| 1．3．4．2 植物抗冻蛋白基因转化植物 | 第21-22页 |
| 2 AFP基因植物表达载体的构建 | 第22-44页 |
| 2．1 实验材料 | 第22-24页 |
| 2．1．1 植物材料 | 第22页 |
| 2．1．2 菌种和质粒 | 第22页 |
| 2．1．3 主要试剂和仪器 | 第22-23页 |
| 2．1．4 PCR扩增引物序列 | 第23页 |
| 2．1．5 培养基配方 | 第23-24页 |
| 2．2 实验方法 | 第24-34页 |
| 2．2．1 35S—AFP基因植物表达载体构建 | 第24-29页 |
| 2．2．1．1 碱裂解法小量提取质粒DNA： | 第24-25页 |
| 2．2．1．2 目的基因afp gene的PCR扩增 | 第25页 |
| 2．2．1．3 质粒与PCR产物的双酶切 | 第25-26页 |
| 2．2．1．4 琼脂糖凝胶回收 | 第26页 |
| 2．2．1．5 DNA片断的连接 | 第26-28页 |
| 2．2．1．6 大肠杆菌感受态的制备 | 第28页 |
| 2．2．1．7 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第28页 |
| 2．2．1．8 农杆菌感受态的制备 | 第28-29页 |
| 2．2．1．9 冻融法转化农杆菌感受态细胞 | 第29页 |
| 2．2．2 Rd29A启动子的克隆 | 第29-31页 |
| 2．2．2．1 拟南芥植物材料的培养 | 第29页 |
| 2．2．2．2 拟南芥总DNA的提取 | 第29-30页 |
| 2．2．2．3 目的基因的PCR扩增 | 第30页 |
| 2．2．2．4 PCR扩增产物的凝胶回收 | 第30页 |
| 2．2．2．5 PCR产物的T-vector连接 | 第30-31页 |
| 2．2．2．6 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第31页 |
| 2．2．2．7 克隆载体的鉴定 | 第31页 |
| 2．2．2．8 Prd29A植物表达载体构建 | 第31页 |
| 2．2．3 Prd29A-AFP基因植物表达载体构建 | 第31-34页 |
| 2．2．3．1 Rd29A启动子与Lig321质粒双酶切 | 第31-32页 |
| 2．2．3．2 双酶切产物的回收与连接 | 第32-33页 |
| 2．2．3．3 连接产物的转化 | 第33-34页 |
| 2．3 实验结果 | 第34-42页 |
| 2．3．1 35S-AFP基因表达载体构建 | 第34-38页 |
| 2．3．1．1 pBI121质粒的提取与酶切 | 第34页 |
| 2．3．1．2 目的基因的PCR扩增及酶切结果 | 第34-35页 |
| 2．3．1．3 双酶切产物的连接与转化结果 | 第35-36页 |
| 2．3．1．4 Lig321质粒测序结果 | 第36-38页 |
| 2．3．2 Prd29A-AFP基因表达载体构建结果 | 第38-42页 |
| 2．3．2．1 Rd29A启动子克隆结果 | 第38-41页 |
| 2．3．2．2 Prd29A启动子与AFP基因连接 | 第41-42页 |
| 2．4 讨论 | 第42-44页 |
| 2．4．1 凝胶回收需注意问题： | 第42页 |
| 2．4．2 PCR产物酶切注意问题 | 第42-43页 |
| 2．4．3 DNA提取需注意问题： | 第43-44页 |
| 3 AFP基因转化烟草及抗寒性检测 | 第44-59页 |
| 3．1 实验材料 | 第44-45页 |
| 3．1．1 植物材料 | 第44页 |
| 3．1．2 培养基配方 | 第44-45页 |
| 3．2 实验方法 | 第45-50页 |
| 3．2．1 烟草AFP基因转化 | 第45-46页 |
| 3．2．1．1 外植体的选择 | 第45页 |
| 3．2．1．2 烟草组织培养 | 第45页 |
| 3．2．1．3 农杆菌浸染转化 | 第45-46页 |
| 3．2．1．4 组培苗的移栽 | 第46页 |
| 3．2．2 转基因植株的检测 | 第46-50页 |
| 3．2．2．1 烟草总DNA的提取 | 第46页 |
| 3．2．2．2 转基因烟草总DNA的PCR检测 | 第46-47页 |
| 3．2．2．3 转基因烟草Southern blotting检测 | 第47-49页 |
| 3．2．2．4 转基因烟草抗寒性检测(电导率法) | 第49-50页 |
| 3．3 实验结果 | 第50-58页 |
| 3．3．1 抗生素筛选 | 第50-51页 |
| 3．3．2 烟草总DNA电泳 | 第51页 |
| 3．3．3 转基因烟草的PCR检测 | 第51-52页 |
| 3．3．4 转基因烟草的Southern blotting检测 | 第52-53页 |
| 3．3．5 两种启动子转化烟草表型差异性 | 第53-54页 |
| 3．3．6 转基因烟草抗寒性检测 | 第54-58页 |
| 3．3．6．1 不同温度处理烟草表型差异 | 第54-56页 |
| 3．3．6．2 低温处理对烟草膜透性影响 | 第56-58页 |
| 3．4 讨论 | 第58-59页 |
| 3．4．1 抗生素的无菌处理 | 第58页 |
| 3．4．2 不定芽的筛选 | 第58页 |
| 3．4．3 电导率测定需注意问题 | 第58-59页 |
| 4 讨论与结论 | 第59-61页 |
| 4．1 讨论 | 第59页 |
| 4．2 小结 | 第59-60页 |
| 4．3 下一步研究工作设想与建议 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-66页 |
| 个人简介 | 第66-67页 |
| 导师简介 | 第67-68页 |
| 致谢 | 第68页 |
