| 中文摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 缩略词表 | 第8-14页 |
| 第一章 PRRSV综述 | 第14-30页 |
| 1 PRRSV研究进展 | 第14-29页 |
| ·PRRS简述 | 第14-15页 |
| ·PRRSV病原学特性 | 第15-16页 |
| ·病原分类 | 第15页 |
| ·PRRSV形态特征 | 第15页 |
| ·病毒的理化性质 | 第15页 |
| ·PRRSV的体外培养特性 | 第15-16页 |
| ·病毒的血凝特性 | 第16页 |
| ·PRRSV基因组结构 | 第16-17页 |
| ·PRRSV编码蛋白及功能 | 第17-18页 |
| ·非结构蛋白 | 第17页 |
| ·结构蛋白 | 第17-18页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征的流行病学 | 第18-19页 |
| ·宿主因素 | 第18页 |
| ·病毒因素 | 第18-19页 |
| ·疫苗因素 | 第19页 |
| ·饲养管理与环境因素的影响 | 第19页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征的免疫学研究进展 | 第19-21页 |
| ·PRRSV致病机理 | 第19-20页 |
| ·体液免疫 | 第20页 |
| ·细胞免疫 | 第20-21页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征诊断方法研究进展 | 第21-26页 |
| ·临床症状 | 第21页 |
| ·病理诊断 | 第21-22页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原检测技术 | 第22-24页 |
| ·病毒分离 | 第22页 |
| ·单克隆抗体技术 | 第22页 |
| ·免疫胶体金技术 | 第22-23页 |
| ·原位杂交技术 | 第23页 |
| ·RT-RCR技术 | 第23-24页 |
| ·荧光定量PCR(Fluorogenetic quantitative PCR,FQ-PCR) | 第24页 |
| ·LAMP(Loop-mediated isothermal amplification,环介导等温扩增) | 第24页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测技术 | 第24-26页 |
| ·免疫过氧化物酶单层试验(IPMA) | 第24-25页 |
| ·间接免疫荧光抗体技术(IFA) | 第25页 |
| ·血清中和试验(SN)检测 | 第25页 |
| ·酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第25页 |
| ·免疫胶体金技术 | 第25-26页 |
| ·PRRSV疫苗 | 第26-28页 |
| ·综合措施 | 第28-29页 |
| ·加强饲养管理 | 第28页 |
| ·建立生物安全制度 | 第28页 |
| ·合理免疫及定期监测 | 第28-29页 |
| 2 本研究的目的与意义 | 第29-30页 |
| 第二章 PRRSV CH-1R株N基因的克隆与生物信息学分析 | 第30-51页 |
| 1 实验材料 | 第30-31页 |
| ·毒株 | 第30页 |
| ·菌株 | 第30页 |
| ·试剂 | 第30-31页 |
| ·溶液配制 | 第31页 |
| ·仪器设备 | 第31页 |
| 2 试验方法 | 第31-38页 |
| ·PRRSV总RNA的制备 | 第31-32页 |
| ·PRRSV N基因的RT-PCR扩增 | 第32-33页 |
| ·N基因引物的设计与合成 | 第32页 |
| ·RNA的反转录 | 第32-33页 |
| ·PCR扩增及电泳检测 | 第33页 |
| ·N基因的TA克隆 | 第33-36页 |
| ·目的片段的回收 | 第33-34页 |
| ·N基因与T载体的连接 | 第34页 |
| ·氯化钙法制备DH5α感受态细胞 | 第34-35页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第35页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第35-36页 |
| ·重组菌的培养 | 第35页 |
| ·重组质粒DNA的提取 | 第35-36页 |
| ·重组pMD-N质粒的PCR鉴定 | 第36页 |
| ·重组pMD-N质粒的双酶切鉴定 | 第36页 |
| ·核苷酸的序列测定 | 第36页 |
| ·N基因的生物信息学分析 | 第36-38页 |
| ·PRRSV N基因核苷酸序列分析 | 第36-37页 |
| ·核苷酸多序列分析 | 第36-37页 |
| ·CpG岛分析 | 第37页 |
| ·密码子使用偏爱性分析 | 第37页 |
| ·稀有密码子分析 | 第37页 |
| ·PRRSV N基因氨基酸序列分析 | 第37-38页 |
| ·氨基酸多序列分析 | 第37页 |
| ·二级结构分析 | 第37页 |
| ·亲疏水性分析 | 第37页 |
| ·跨膜区分析 | 第37-38页 |
| ·抗原位点预测分析 | 第38页 |
| ·信号肽分析 | 第38页 |
| 3 结果与分析 | 第38-49页 |
| ·N基因的PCR扩增 | 第38页 |
| ·重组质粒pMD-N鉴定 | 第38页 |
| ·PRRSV N基因测序结果 | 第38-40页 |
| ·PRRSV N基因的核苷酸序列分析 | 第40-45页 |
| ·多序列对比 | 第40-43页 |
| ·核苷酸序列同源性及进化树分析 | 第43-44页 |
| ·CpG岛分析 | 第44页 |
| ·密码子使用偏爱性分析 | 第44页 |
| ·稀有密码子分析 | 第44-45页 |
| ·PRRSV N基因氨基酸序列分析 | 第45-49页 |
| ·氨基酸多序列分析 | 第45-47页 |
| ·二级结构分析 | 第47-48页 |
| ·亲疏水性分析 | 第48页 |
| ·跨膜区分析 | 第48页 |
| ·PRRSV N基因推导的氨基酸序列抗原位点预测分析 | 第48-49页 |
| ·信号肽分析 | 第49页 |
| 4 讨论 | 第49-51页 |
| 第三章 PRRSV CH-1R株N基因的原核 #38表达 | 第51-64页 |
| 1 材料 | 第51-53页 |
| ·菌株 | 第51页 |
| ·载体 | 第51页 |
| ·质粒 | 第51页 |
| ·试剂 | 第51页 |
| ·溶液配制 | 第51-53页 |
| ·仪器 | 第53页 |
| 2 试验方法 | 第53-57页 |
| ·目的片段的制备 | 第53页 |
| ·pET-32a(+)的制备 | 第53-54页 |
| ·PET-N的构建 | 第54页 |
| ·PET-N转化DH5α及鉴定 | 第54-55页 |
| ·PET-N转化E.coli Rosetta(DE3)及鉴定 | 第55页 |
| ·重组表达菌的诱导表达 | 第55-56页 |
| ·IPTG浓度的优化 | 第55页 |
| ·诱导时间的优化 | 第55-56页 |
| ·诱导温度的优化 | 第56页 |
| ·融合表达蛋白的SDS-PAGE电泳检测 | 第56-57页 |
| ·重组表达蛋白的可溶性检测 | 第57页 |
| ·重组表达蛋白的Western-blot鉴定 | 第57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-62页 |
| ·重组质粒pET-N的构建 | 第57-58页 |
| ·SDS-PAGE检测重组表达蛋白 | 第58页 |
| ·N蛋白表达条件的优化 | 第58-60页 |
| ·IPTG浓度优化 | 第58-59页 |
| ·不同诱导时间优化 | 第59-60页 |
| ·不同温度优化 | 第60页 |
| ·重组表达蛋白的可溶性检测 | 第60-61页 |
| ·融合表达产物的反应原性(Western-Blot) | 第61-62页 |
| 4 讨论 | 第62-64页 |
| 第四章 PRRSV CH1-R株N蛋白表达纯化及间接ELISA检测方法的初步建立 | 第64-78页 |
| 1 实验材料 | 第64-66页 |
| ·质粒 | 第64页 |
| ·血清 | 第64页 |
| ·试剂 | 第64-65页 |
| ·溶液配制 | 第65页 |
| ·仪器及耗材 | 第65-66页 |
| 2 试验方法 | 第66-69页 |
| ·重组蛋白的表达及纯化 | 第66页 |
| ·重组蛋白制备 | 第66页 |
| ·PRRSV重组N蛋白的纯化 | 第66页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第66-67页 |
| ·PRRSV N-ELISA的初步建立 | 第67-68页 |
| ·抗原抗体最佳反应条件的测定 | 第67页 |
| ·最适封闭液的确定 | 第67-68页 |
| ·血清作用时间的确定 | 第68页 |
| ·酶标二抗稀释倍数和作用时间的试验 | 第68页 |
| ·底物反应时间的确定 | 第68页 |
| ·血清阴阳性的判定 | 第68页 |
| ·特异性试验 | 第68-69页 |
| ·交叉试验 | 第68-69页 |
| ·阻断试验 | 第69页 |
| ·重复性试验 | 第69页 |
| ·批内重复 | 第69页 |
| ·批间重复 | 第69页 |
| ·与商业化试剂盒对比 | 第69页 |
| 3 结果与分析 | 第69-75页 |
| ·PRRSV重组N蛋白的纯化 | 第69-70页 |
| ·抗原和抗体最佳稀释浓度的确定 | 第70-71页 |
| ·最适封闭液的确定 | 第71页 |
| ·血清最适结合时间的确定 | 第71-72页 |
| ·酶标二抗最佳作用条件的确定 | 第72页 |
| ·底物反应时间的确定 | 第72-73页 |
| ·血清阴阳性判定 | 第73页 |
| ·特异性试验 | 第73-74页 |
| ·交叉试验 | 第73页 |
| ·阻断试验 | 第73-74页 |
| ·重复性试验 | 第74-75页 |
| ·批内重复 | 第74页 |
| ·批间重复 | 第74-75页 |
| ·与标准试剂盒抗体检测结果比较 | 第75页 |
| 4 讨论 | 第75-78页 |
| 全文总结 | 第78-79页 |
| 创新点 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-86页 |
| 致谢 | 第86页 |
