| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第一章 RNA沉默与植物抗病毒特性 | 第11-20页 |
| 1 引言 | 第11-12页 |
| 2 RNA沉默在生物界存在的普遍性 | 第12-14页 |
| ·植物中的转录后基因沉默(PTGS) | 第12-14页 |
| ·转基因植物的共抑制现象 | 第12页 |
| ·RNA介导的病毒抗性(RMVR) | 第12-13页 |
| ·病毒诱导的基因沉默(VIGS) | 第13-14页 |
| ·真菌中的消除作用 | 第14页 |
| ·动物中的RNA干扰 | 第14页 |
| 3 RNA沉默的机制 | 第14-16页 |
| 4 RNA沉默的信号 | 第16-17页 |
| ·信号的传导 | 第16-17页 |
| ·可能的信号分子 | 第17页 |
| 5 RNA沉默的病毒抑制子 | 第17-20页 |
| 第二章 研究目的意义、主要内容和技术路线 | 第20-22页 |
| 1 研究的目的和意义 | 第20-21页 |
| 2 主要研究内容 | 第21页 |
| 3 技术路线 | 第21-22页 |
| 第三章 常用方法 | 第22-34页 |
| 1 分子克隆常用方法 | 第22-26页 |
| ·一般PCR反应 | 第22页 |
| ·PCR产物纯化 | 第22-23页 |
| ·感受态细胞制备方法(CaCl_2法) | 第23页 |
| ·连接 | 第23页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第23-24页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第24-26页 |
| ·煮沸法少量提取质粒 | 第24页 |
| ·碱裂解法提取质粒 | 第24-25页 |
| ·重组质粒的提取纯化(用QIApRep Spin MinipRep Kit) | 第25页 |
| ·重组质粒的试剂盒提取(用UMIQ-10柱离心式质粒小量抽提试剂盒，Sangon公司) | 第25-26页 |
| ·重组质粒PCR鉴定 | 第26页 |
| ·酶切鉴定 | 第26页 |
| 2 三亲交配法 | 第26-27页 |
| 3 烟草转化及与卡那霉素抗性植株的再生 | 第27-28页 |
| ·农杆菌的培养 | 第27页 |
| ·烟草叶片的准备 | 第27页 |
| ·预培养 | 第27页 |
| ·农杆菌侵染 | 第27页 |
| ·共培养、筛选培养、继代培养 | 第27-28页 |
| ·生根培养 | 第28页 |
| ·土壤种植 | 第28页 |
| 4 间接ELISA | 第28页 |
| 5 植物基因组总DNA的提取 | 第28-29页 |
| 6 Southern blot印迹分析 | 第29-31页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第29页 |
| ·电泳及转膜 | 第29-30页 |
| ·探针的制备(用Promega公司的Prime-a-Gene Labeling kit) | 第30-31页 |
| ·杂交 | 第31页 |
| 7 Northern blot分析 | 第31-34页 |
| ·器皿和容器的处理 | 第31页 |
| ·烟草总RNA的提取 | 第31-32页 |
| ·甲醛变性电泳 | 第32页 |
| ·RNA转膜 | 第32-34页 |
| 第四章 TMV ΔMP基因反向重复植物表达载体的构建 | 第34-39页 |
| 1 材料 | 第34页 |
| ·菌种、质粒 | 第34页 |
| ·酶、化学试剂 | 第34页 |
| ·抗生素 | 第34页 |
| 2 方法 | 第34-35页 |
| ·目的基因的获得 | 第34-35页 |
| ·ΔMP基因的引物设计与合成 | 第34-35页 |
| ·PCR扩增ΔMP基因 | 第35页 |
| ·反向重复植物表达载体的获得 | 第35页 |
| ·ΔMP基因反向重复植物表达载体的获得 | 第35页 |
| 3 结果 | 第35-38页 |
| ·ΔMP基因的克隆和和反向重复植物表达载体的构建 | 第35-38页 |
| ·ΔMP基因的获得 | 第35-37页 |
| ·反向重复表达载体的构建 | 第37-38页 |
| ·三亲交配法将pBIN-TMV ΔMP(i／r)导入农杆菌EH105 | 第38页 |
| 4 讨论 | 第38-39页 |
| 第五章 反向重复ΔMP基因在烟草中的表达及对TMV的抗病性分析 | 第39-48页 |
| 1 材料 | 第39页 |
| ·转化的受体植物 | 第39页 |
| ·菌株与质粒 | 第39页 |
| ·培养基与抗生素 | 第39页 |
| ·供试毒源 | 第39页 |
| ·抗血清 | 第39页 |
| 2 方法 | 第39-42页 |
| ·烟草的转化及卡那霉素抗性植株的获得 | 第39页 |
| ·转基因植株的抗病性分析 | 第39-40页 |
| ·磨擦接种法 | 第39-40页 |
| ·TMV的间接ELISA | 第40页 |
| ·转基因烟草的分子生物学鉴定 | 第40-42页 |
| ·PCR检测 | 第40-41页 |
| ·烟草基因组DNA的提取 | 第40页 |
| ·PCR检测 | 第40-41页 |
| ·转基因烟草植株的Southern blot分析 | 第41页 |
| ·烟草基因组DNA的提取 | 第41页 |
| ·电泳及转膜 | 第41页 |
| ·探针的制备(用Promega公司的Prime-a-Gene Labeling kit) | 第41页 |
| ·杂交 | 第41页 |
| ·转基因烟草植株的Northern blot分析 | 第41-42页 |
| ·器皿和容器的处理 | 第41页 |
| ·烟草总RNA的提取 | 第41页 |
| ·RNA电泳及转膜 | 第41页 |
| ·探针的制备 | 第41页 |
| ·Northern blot杂交 | 第41-42页 |
| 3 结果 | 第42-46页 |
| ·烟草的转化和卡那抗性植株的获得 | 第42页 |
| ·转基因植株对TMV的抗性分析 | 第42-44页 |
| ·症状观察 | 第43页 |
| ·TAS-ELISA检测 | 第43-44页 |
| ·转基因烟草植株的分子生物学检测 | 第44-46页 |
| ·转基因植株的PCR检测 | 第44页 |
| ·转基因植株的Southern印迹杂交分析 | 第44-45页 |
| ·转基因植株Northern blot分析 | 第45-46页 |
| 4 讨论 | 第46-48页 |
| 参考文献 | 第48-54页 |
| 附录A: 本文所用的重要缩写词及中文对照 | 第54-55页 |
| 附录B: 常用缓冲液及培养基配方 | 第55-61页 |
| 附录C: 常用的抗生素及使用浓度 | 第61-62页 |
| 附录D: 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器 | 第62-63页 |
