| 提要 | 第1-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-61页 |
| 第一节 谷胱甘肽过氧化物酶 | 第17-29页 |
| 一、谷胱甘肽过氧化物酶的结构 | 第17-19页 |
| ·牛cGPx 的二级结构 | 第17-18页 |
| ·牛cGPx 活性中心的结构 | 第18-19页 |
| ·人pGPx 的活性中心结构 | 第19页 |
| 二、谷胱甘肽过氧化物酶的生物学作用 | 第19-21页 |
| 三、谷胱甘肽过氧化物酶的催化机制 | 第21-24页 |
| ·乒乓机制 | 第22-23页 |
| ·顺序机制 | 第23-24页 |
| 四、谷胱甘肽过氧化物酶的人工模拟 | 第24-29页 |
| ·小分子化学酶模型 | 第24-26页 |
| ·含硒抗体酶 | 第26-27页 |
| ·生物印迹酶 | 第27-28页 |
| ·半合成含硒酶 | 第28-29页 |
| 第二节 硒代半胱氨酸的生物合成 | 第29-37页 |
| 一、硒蛋白的生物合成 | 第30-32页 |
| 二、原核生物的硒代半胱氨酸插入元件 | 第32-33页 |
| 三、真核生物的SECIS | 第33-35页 |
| 四、硒蛋白的原核表达 | 第35-36页 |
| 五、利用半胱氨酸缺陷型大肠杆菌原核表达硒蛋白 | 第36-37页 |
| 第三节 枯草杆菌蛋白酶蛋白质的分子设计与改造 | 第37-53页 |
| 一、蛋白质工程的基本原理及研究内容 | 第38-41页 |
| ·蛋白质工程的由来和目标 | 第39页 |
| ·蛋白质工程原理和基本操作 | 第39-41页 |
| 二、酶模型的选择与构建 | 第41-46页 |
| ·酶模型的选择 | 第41-44页 |
| ·硒代枯草杆菌蛋白酶的构建 | 第44-46页 |
| 三 酶分子的设计与改造 | 第46-53页 |
| ·蛋白质的结构预测 | 第47-51页 |
| ·蛋白质结构的理论计算 | 第51-52页 |
| ·人工设计合成酶蛋白 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-61页 |
| 第二章 本论文立论依据 | 第61-68页 |
| 1. 硒代枯草杆菌蛋白酶模拟GPx | 第62-64页 |
| 2. 硒代枯草杆菌蛋白酶的催化位点的重新设计 | 第64页 |
| 参考文献 | 第64-68页 |
| 第三章 硒代枯草杆菌蛋白酶模拟GPX | 第68-116页 |
| 第一节 序言 | 第68-70页 |
| 第二节硒代枯草杆菌蛋白酶表达载体的构建 | 第70-75页 |
| 一、实验材料 | 第70-71页 |
| ·主要试剂 | 第70-71页 |
| ·菌株与质粒 | 第71页 |
| ·主要仪器 | 第71页 |
| 二、实验方法 | 第71-73页 |
| ·目的基因的定点突变 | 第71-72页 |
| ·DpnI 酶切 | 第72页 |
| ·筛选已突变的质粒 | 第72-73页 |
| ·转化 | 第73页 |
| 三、结果与讨论 | 第73-75页 |
| ·快速一步定点突变方法及原理 | 第73-74页 |
| ·测序结果 | 第74-75页 |
| 第三节 硒代枯草杆菌蛋白酶、野生型枯草杆菌蛋白酶及其突变体的表达、纯化、体外复性及表征 | 第75-95页 |
| 一、实验材料 | 第75-78页 |
| ·主要试剂 | 第75-76页 |
| ·实验仪器 | 第76-77页 |
| ·主要溶液的配制 | 第77-78页 |
| 二、实验方法 | 第78-82页 |
| ·野生型枯草杆菌蛋白酶的诱导表达 | 第78-79页 |
| ·硫代枯草杆菌蛋白酶的诱导表达 | 第79-80页 |
| ·硒代枯草杆菌蛋白酶的诱导表达 | 第80页 |
| ·野生型枯草杆菌蛋白酶、硫代及硒代枯草杆菌蛋白酶的分离提纯 | 第80-81页 |
| ·野生型枯草杆菌蛋白酶、硫代及硒代枯草杆菌蛋白酶的复性 | 第81页 |
| ·野生型枯草杆菌蛋白酶、硫代及硒代枯草杆菌蛋白酶复性后的再纯化 | 第81页 |
| ·电泳分析 | 第81页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第81-82页 |
| ·硒含量的测定 | 第82页 |
| ·质谱鉴定 | 第82页 |
| ·圆二色谱分析 | 第82页 |
| 三、结果分析 | 第82-92页 |
| ·野生型枯草杆菌蛋白酶的表达与分离提纯 | 第82-84页 |
| ·硫代枯草杆菌蛋白酶的诱导表达与分离提纯 | 第84页 |
| ·硒代枯草杆菌蛋白酶的诱导表达与分离提纯 | 第84-86页 |
| ·野生型枯草杆菌蛋白酶的体外复性 | 第86-87页 |
| ·硫代枯草杆菌蛋白酶的体外复性 | 第87-88页 |
| ·硒代枯草杆菌蛋白酶的体外复性 | 第88-89页 |
| ·野生型枯草杆菌蛋白酶、硫代枯草杆菌蛋白酶及硒代枯草杆菌蛋白酶复性后的再纯化 | 第89-90页 |
| ·硒代枯草杆菌蛋白酶复性过程中酶活力的恢复 | 第90页 |
| ·硒代枯草杆菌蛋白酶中硒含量的测定 | 第90-91页 |
| ·硒代枯草杆菌蛋白酶的质谱鉴定 | 第91页 |
| ·圆二色谱分析 | 第91-92页 |
| 四、讨论 | 第92-95页 |
| 第四节硒代枯草杆菌蛋白酶的酶学性质分析 | 第95-105页 |
| 一、实验材料 | 第95页 |
| 二、实验方法 | 第95-98页 |
| ·活力的测定 | 第95-97页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第97页 |
| ·温度Tm 和pH 值对模拟酶活性影响的测定 | 第97-98页 |
| 三、结果分析 | 第98-102页 |
| ·硒代枯草杆菌蛋白酶的水解活性 | 第98-99页 |
| ·硒代枯草杆菌蛋白酶催化TNB 对H_2O_2 的还原反应 | 第99-100页 |
| ·硒代枯草杆菌蛋白酶催化TNB 对H_2O_2、t-BuOOH 和的还原反应 | 第100-101页 |
| ·温度和pH 值对催化反应的影响 | 第101-102页 |
| ·硒代枯草杆菌蛋白酶的稳定性 | 第102页 |
| 四、讨论 | 第102-105页 |
| 第五节 硒代枯草杆菌蛋白酶的动力学研究 | 第105-112页 |
| 一、实验材料 | 第105页 |
| 二、实验方法 | 第105-106页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第105页 |
| ·稳态动力学性质研究 | 第105-106页 |
| 三、结果分析 | 第106-111页 |
| 四、讨论 | 第111-112页 |
| 本章小结 | 第112-113页 |
| 参考文献 | 第113-116页 |
| 第四章 硒代枯草杆菌蛋白酶活性中心的重新设计 | 第116-133页 |
| 第一节 序言 | 第116-119页 |
| 第二节 对已知酶和底物相互作用的计算机模拟 | 第119-124页 |
| 一、实验方法 | 第119页 |
| 二、结果与讨论 | 第119-124页 |
| ·枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列 | 第119-120页 |
| ·枯草杆菌蛋白酶的晶体结构 | 第120页 |
| ·硒代枯草杆菌蛋白酶与三种底物的分子对接模拟图 | 第120-124页 |
| 第三节 硒代枯草杆菌蛋白酶活性中心的重新设计 | 第124-129页 |
| 一、实验方法 | 第124页 |
| 二、结果与讨论 | 第124-129页 |
| ·最佳催化位点的确定 | 第124-125页 |
| ·Seleno~(221)-subtilisin E 与底物TNB 结合方式的模拟 | 第125-126页 |
| ·Seleno~(63)-subtilisin E 与底物TNB 结合方式的模拟 | 第126-128页 |
| ·比较seleno~(221)-subtilisin E和seleno~(63)-subtilisin E活性中心主要基酸与底物TNB 之间的相互作用 | 第128页 |
| ·比较Seleno~(221)-subtilisin E 和Seleno~(63)-subtilisin E 活性中心主氨基酸与底物TNB 相互作用的总能量 | 第128-129页 |
| 本章小结 | 第129-130页 |
| 参考文献 | 第130-133页 |
| 第五章 重构硒代枯草杆菌蛋白酶 | 第133-169页 |
| 第一节 序言 | 第133-135页 |
| 第二节 硒代枯草杆菌蛋白酶催化位点的重新构建 | 第135-138页 |
| 一、实验材料 | 第135-136页 |
| ·主要试剂 | 第135页 |
| ·菌株与质粒 | 第135页 |
| ·主要仪器 | 第135-136页 |
| 二、实验方法 | 第136-137页 |
| ·目的基因的定点突变563C 的引入 | 第136页 |
| ·DpnI 酶切 | 第136页 |
| ·筛选已突变的质粒 | 第136-137页 |
| ·转化 | 第137页 |
| 三、结果与讨论 | 第137-138页 |
| ·测序结果 | 第137-138页 |
| 第三节 63 位硒代枯草杆菌蛋白酶及硫代枯草杆菌蛋白酶的表达、纯化体外复性及表征 | 第138-147页 |
| 一、实验材料 | 第138-139页 |
| ·主要试剂 | 第138-139页 |
| ·实验仪器 | 第139页 |
| 二、实验方法 | 第139-143页 |
| ·63 位硫代枯草杆菌蛋白酶的表达与分离纯化 | 第139-140页 |
| ·63 位硫代枯草杆菌蛋白酶的体外复性及其复性后再纯化.. | 第140-141页 |
| ·63 位硒代枯草杆菌蛋白酶的表达与分离纯化 | 第141页 |
| ·63 位硒代枯草杆菌蛋白酶的体外复性及其复性后再纯化.. | 第141-142页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第142页 |
| ·硒含量的测定 | 第142页 |
| ·质谱鉴定 | 第142页 |
| ·圆二色谱分析 | 第142-143页 |
| 三、结果与讨论 | 第143-147页 |
| ·63 位硒代枯草杆菌蛋白酶复性后再纯化 | 第143-144页 |
| ·高效液相(HPLC)跟踪监测63 位硒代枯草杆菌蛋白酶的体外复性过程 | 第144-145页 |
| ·质谱鉴定 | 第145-146页 |
| ·圆二色谱分析 | 第146-147页 |
| 第四节 63 位硒代枯草杆菌蛋白酶酶学性质研究 | 第147-155页 |
| 一、实验材料 | 第147页 |
| 二、实验方法 | 第147-148页 |
| ·活力的测定 | 第147-148页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第148页 |
| ·温度Tm 和pH 值对模拟酶活性影响的测定 | 第148页 |
| 三、结果分析 | 第148-155页 |
| ·Seleno~(63)-subtilisin E 的水解活性 | 第148-150页 |
| ·Seleno~(63)-subtilisin E 催化GSH 对H_2O_2 的还原反应 | 第150页 |
| ·Seleno~(63)-subtilisin E 催化TNB 对H_2O_2、t-BuOOH 和CuOOH 的还原反应 | 第150-152页 |
| ·温度和pH 值对催化反应的影响 | 第152-155页 |
| 第五节 63 位硒代枯草杆菌蛋白酶的动力学性质研究 | 第155-166页 |
| 一、实验材料 | 第155页 |
| 二、实验方法 | 第155-156页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第155页 |
| ·酶与底物TNB 的结合常数测定 | 第155-156页 |
| ·稳态动力学性质研究 | 第156页 |
| 三、结果与讨论 | 第156-166页 |
| ·Thiol~(63)-subtilisin E 与ArSH 的结合常数测定 | 第156-157页 |
| ·Thiol~(221)-subtilisin E 与ArSH 的结合常数测定 | 第157-158页 |
| ·野生型subtilisin E 与ArSH 的结合常数测定 | 第158-159页 |
| ·稳态动力学性质研究 | 第159-166页 |
| 本章小结 | 第166页 |
| 参考文献 | 第166-169页 |
| 结论 | 第169-171页 |
| 作者简历 | 第171页 |
| 博士期间发表的论文 | 第171-173页 |
| 致谢 | 第173-174页 |
| 中文摘要 | 第174-179页 |
| ABSTRACT | 第179-183页 |
