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基因工程方法构建高GPx活性的含硒抗氧化酶

提要第1-17页
第一章 文献综述第17-61页
 第一节 谷胱甘肽过氧化物酶第17-29页
  一、谷胱甘肽过氧化物酶的结构第17-19页
   ·牛cGPx 的二级结构第17-18页
   ·牛cGPx 活性中心的结构第18-19页
   ·人pGPx 的活性中心结构第19页
  二、谷胱甘肽过氧化物酶的生物学作用第19-21页
  三、谷胱甘肽过氧化物酶的催化机制第21-24页
   ·乒乓机制第22-23页
   ·顺序机制第23-24页
  四、谷胱甘肽过氧化物酶的人工模拟第24-29页
   ·小分子化学酶模型第24-26页
   ·含硒抗体酶第26-27页
   ·生物印迹酶第27-28页
   ·半合成含硒酶第28-29页
 第二节 硒代半胱氨酸的生物合成第29-37页
  一、硒蛋白的生物合成第30-32页
  二、原核生物的硒代半胱氨酸插入元件第32-33页
  三、真核生物的SECIS第33-35页
  四、硒蛋白的原核表达第35-36页
  五、利用半胱氨酸缺陷型大肠杆菌原核表达硒蛋白第36-37页
 第三节 枯草杆菌蛋白酶蛋白质的分子设计与改造第37-53页
  一、蛋白质工程的基本原理及研究内容第38-41页
   ·蛋白质工程的由来和目标第39页
   ·蛋白质工程原理和基本操作第39-41页
  二、酶模型的选择与构建第41-46页
   ·酶模型的选择第41-44页
   ·硒代枯草杆菌蛋白酶的构建第44-46页
  三 酶分子的设计与改造第46-53页
   ·蛋白质的结构预测第47-51页
   ·蛋白质结构的理论计算第51-52页
   ·人工设计合成酶蛋白第52-53页
 参考文献第53-61页
第二章 本论文立论依据第61-68页
 1. 硒代枯草杆菌蛋白酶模拟GPx第62-64页
 2. 硒代枯草杆菌蛋白酶的催化位点的重新设计第64页
 参考文献第64-68页
第三章 硒代枯草杆菌蛋白酶模拟GPX第68-116页
 第一节 序言第68-70页
 第二节硒代枯草杆菌蛋白酶表达载体的构建第70-75页
  一、实验材料第70-71页
   ·主要试剂第70-71页
   ·菌株与质粒第71页
   ·主要仪器第71页
  二、实验方法第71-73页
   ·目的基因的定点突变第71-72页
   ·DpnI 酶切第72页
   ·筛选已突变的质粒第72-73页
   ·转化第73页
  三、结果与讨论第73-75页
   ·快速一步定点突变方法及原理第73-74页
   ·测序结果第74-75页
 第三节 硒代枯草杆菌蛋白酶、野生型枯草杆菌蛋白酶及其突变体的表达、纯化、体外复性及表征第75-95页
  一、实验材料第75-78页
   ·主要试剂第75-76页
   ·实验仪器第76-77页
   ·主要溶液的配制第77-78页
  二、实验方法第78-82页
   ·野生型枯草杆菌蛋白酶的诱导表达第78-79页
   ·硫代枯草杆菌蛋白酶的诱导表达第79-80页
   ·硒代枯草杆菌蛋白酶的诱导表达第80页
   ·野生型枯草杆菌蛋白酶、硫代及硒代枯草杆菌蛋白酶的分离提纯第80-81页
   ·野生型枯草杆菌蛋白酶、硫代及硒代枯草杆菌蛋白酶的复性第81页
   ·野生型枯草杆菌蛋白酶、硫代及硒代枯草杆菌蛋白酶复性后的再纯化第81页
   ·电泳分析第81页
   ·蛋白质浓度的测定第81-82页
   ·硒含量的测定第82页
   ·质谱鉴定第82页
   ·圆二色谱分析第82页
  三、结果分析第82-92页
   ·野生型枯草杆菌蛋白酶的表达与分离提纯第82-84页
   ·硫代枯草杆菌蛋白酶的诱导表达与分离提纯第84页
   ·硒代枯草杆菌蛋白酶的诱导表达与分离提纯第84-86页
   ·野生型枯草杆菌蛋白酶的体外复性第86-87页
   ·硫代枯草杆菌蛋白酶的体外复性第87-88页
   ·硒代枯草杆菌蛋白酶的体外复性第88-89页
   ·野生型枯草杆菌蛋白酶、硫代枯草杆菌蛋白酶及硒代枯草杆菌蛋白酶复性后的再纯化第89-90页
   ·硒代枯草杆菌蛋白酶复性过程中酶活力的恢复第90页
   ·硒代枯草杆菌蛋白酶中硒含量的测定第90-91页
   ·硒代枯草杆菌蛋白酶的质谱鉴定第91页
   ·圆二色谱分析第91-92页
  四、讨论第92-95页
 第四节硒代枯草杆菌蛋白酶的酶学性质分析第95-105页
  一、实验材料第95页
  二、实验方法第95-98页
   ·活力的测定第95-97页
   ·蛋白质含量测定第97页
   ·温度Tm 和pH 值对模拟酶活性影响的测定第97-98页
  三、结果分析第98-102页
   ·硒代枯草杆菌蛋白酶的水解活性第98-99页
   ·硒代枯草杆菌蛋白酶催化TNB 对H_2O_2 的还原反应第99-100页
   ·硒代枯草杆菌蛋白酶催化TNB 对H_2O_2、t-BuOOH 和的还原反应第100-101页
   ·温度和pH 值对催化反应的影响第101-102页
   ·硒代枯草杆菌蛋白酶的稳定性第102页
  四、讨论第102-105页
 第五节 硒代枯草杆菌蛋白酶的动力学研究第105-112页
  一、实验材料第105页
  二、实验方法第105-106页
   ·蛋白质含量测定第105页
   ·稳态动力学性质研究第105-106页
  三、结果分析第106-111页
  四、讨论第111-112页
 本章小结第112-113页
 参考文献第113-116页
第四章 硒代枯草杆菌蛋白酶活性中心的重新设计第116-133页
 第一节 序言第116-119页
 第二节 对已知酶和底物相互作用的计算机模拟第119-124页
  一、实验方法第119页
  二、结果与讨论第119-124页
   ·枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列第119-120页
   ·枯草杆菌蛋白酶的晶体结构第120页
   ·硒代枯草杆菌蛋白酶与三种底物的分子对接模拟图第120-124页
 第三节 硒代枯草杆菌蛋白酶活性中心的重新设计第124-129页
  一、实验方法第124页
  二、结果与讨论第124-129页
   ·最佳催化位点的确定第124-125页
   ·Seleno~(221)-subtilisin E 与底物TNB 结合方式的模拟第125-126页
   ·Seleno~(63)-subtilisin E 与底物TNB 结合方式的模拟第126-128页
   ·比较seleno~(221)-subtilisin E和seleno~(63)-subtilisin E活性中心主要基酸与底物TNB 之间的相互作用第128页
   ·比较Seleno~(221)-subtilisin E 和Seleno~(63)-subtilisin E 活性中心主氨基酸与底物TNB 相互作用的总能量第128-129页
 本章小结第129-130页
 参考文献第130-133页
第五章 重构硒代枯草杆菌蛋白酶第133-169页
 第一节 序言第133-135页
 第二节 硒代枯草杆菌蛋白酶催化位点的重新构建第135-138页
  一、实验材料第135-136页
   ·主要试剂第135页
   ·菌株与质粒第135页
   ·主要仪器第135-136页
  二、实验方法第136-137页
   ·目的基因的定点突变563C 的引入第136页
   ·DpnI 酶切第136页
   ·筛选已突变的质粒第136-137页
   ·转化第137页
  三、结果与讨论第137-138页
   ·测序结果第137-138页
 第三节 63 位硒代枯草杆菌蛋白酶及硫代枯草杆菌蛋白酶的表达、纯化体外复性及表征第138-147页
  一、实验材料第138-139页
   ·主要试剂第138-139页
   ·实验仪器第139页
  二、实验方法第139-143页
   ·63 位硫代枯草杆菌蛋白酶的表达与分离纯化第139-140页
   ·63 位硫代枯草杆菌蛋白酶的体外复性及其复性后再纯化..第140-141页
   ·63 位硒代枯草杆菌蛋白酶的表达与分离纯化第141页
   ·63 位硒代枯草杆菌蛋白酶的体外复性及其复性后再纯化..第141-142页
   ·蛋白质浓度的测定第142页
   ·硒含量的测定第142页
   ·质谱鉴定第142页
   ·圆二色谱分析第142-143页
  三、结果与讨论第143-147页
   ·63 位硒代枯草杆菌蛋白酶复性后再纯化第143-144页
   ·高效液相(HPLC)跟踪监测63 位硒代枯草杆菌蛋白酶的体外复性过程第144-145页
   ·质谱鉴定第145-146页
   ·圆二色谱分析第146-147页
 第四节 63 位硒代枯草杆菌蛋白酶酶学性质研究第147-155页
  一、实验材料第147页
  二、实验方法第147-148页
   ·活力的测定第147-148页
   ·蛋白质含量测定第148页
   ·温度Tm 和pH 值对模拟酶活性影响的测定第148页
  三、结果分析第148-155页
   ·Seleno~(63)-subtilisin E 的水解活性第148-150页
   ·Seleno~(63)-subtilisin E 催化GSH 对H_2O_2 的还原反应第150页
   ·Seleno~(63)-subtilisin E 催化TNB 对H_2O_2、t-BuOOH 和CuOOH 的还原反应第150-152页
   ·温度和pH 值对催化反应的影响第152-155页
 第五节 63 位硒代枯草杆菌蛋白酶的动力学性质研究第155-166页
  一、实验材料第155页
  二、实验方法第155-156页
   ·蛋白质含量测定第155页
   ·酶与底物TNB 的结合常数测定第155-156页
   ·稳态动力学性质研究第156页
  三、结果与讨论第156-166页
   ·Thiol~(63)-subtilisin E 与ArSH 的结合常数测定第156-157页
   ·Thiol~(221)-subtilisin E 与ArSH 的结合常数测定第157-158页
   ·野生型subtilisin E 与ArSH 的结合常数测定第158-159页
   ·稳态动力学性质研究第159-166页
 本章小结第166页
 参考文献第166-169页
结论第169-171页
作者简历第171页
博士期间发表的论文第171-173页
致谢第173-174页
中文摘要第174-179页
ABSTRACT第179-183页

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