| 目录 | 第1-6页 |
| 中文摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 符号及缩略词说明 | 第10-12页 |
| 第一章 前言 | 第12-26页 |
| 1 马铃薯Y病毒及马铃薯病毒控制研究 | 第12-15页 |
| ·马铃薯病毒性病害 | 第12页 |
| ·马铃薯Y病毒(PVY) | 第12-13页 |
| ·马铃薯病毒控制研究现状 | 第13-15页 |
| 2 RNAi的作用机制及其在抗病毒领域的应用 | 第15-22页 |
| ·RNAi的发现 | 第15-16页 |
| ·RNAi的机制 | 第16-18页 |
| ·起始阶段 | 第16-17页 |
| ·效应阶段 | 第17-18页 |
| ·循环放大阶段 | 第18页 |
| ·RNAi相关功能蛋白 | 第18-19页 |
| ·Dicer酶 | 第18-19页 |
| ·RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC) | 第19页 |
| ·RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase) | 第19页 |
| ·RNAi的特点 | 第19-20页 |
| ·高效性 | 第19-20页 |
| ·RNAi具有高度的特异性 | 第20页 |
| ·传递性 | 第20页 |
| ·需要ATP | 第20页 |
| ·RNAi在抗病毒基因工程上的应用 | 第20-22页 |
| 3 农杆菌渗入法介导的瞬时基因表达(Agroinfiltration) | 第22-24页 |
| ·Agroinfiltration系统的建立和发展 | 第22页 |
| ·Agroinfiltration的原理 | 第22-23页 |
| ·Agroinfiltration与稳定转基因的比较 | 第23-24页 |
| 4 本研究的目的及意义 | 第24-26页 |
| 第二章 贵州马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的克隆与遗传分析 | 第26-37页 |
| 1 材料和方法 | 第26-32页 |
| ·材料 | 第26-27页 |
| ·植物材料 | 第26页 |
| ·序列来源 | 第26页 |
| ·引物的设计与合成 | 第26页 |
| ·试剂 | 第26-27页 |
| ·仪器 | 第27页 |
| ·方法 | 第27-32页 |
| ·TC-RT-PCR方法 | 第27-29页 |
| ·PCR产物纯化 | 第29页 |
| ·质粒DNA与目的片段DNA的连接(表2-2) | 第29页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第29-30页 |
| ·质粒DNA向大肠杆菌中的转化(热激法) | 第30-31页 |
| ·菌落PCR鉴定 | 第31页 |
| ·反应体系(表2-3) | 第31页 |
| ·菌落PCR操作过程 | 第31页 |
| ·测序 | 第31页 |
| ·序列分析及系统发育树的构建 | 第31-32页 |
| 2 结果与分析 | 第32-34页 |
| ·TC-RT-PCR克隆PVY外壳蛋白基因 | 第32页 |
| ·序列同源性比较及系统树的构建 | 第32-34页 |
| 3 讨论 | 第34-36页 |
| 4 PVY外壳蛋白序列分析在RNAi介导抗病毒上的意义 | 第36-37页 |
| 第三章 反向重复结构载体的构建与瞬时表达分析 | 第37-61页 |
| 1 材料与方法 | 第37-50页 |
| ·材料 | 第37-38页 |
| ·毒源和抗血清 | 第37页 |
| ·供试植物 | 第37页 |
| ·菌种、质粒、主要试剂 | 第37-38页 |
| ·仪器 | 第38页 |
| ·方法 | 第38-50页 |
| ·pROKⅡ系列载体构建 | 第38-42页 |
| ·构建策略 | 第38页 |
| ·目的DNA片段的获得 | 第38-40页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第40页 |
| ·DNA的酶切 | 第40-41页 |
| ·质粒DNA与目的片段DNA的连接 | 第41页 |
| ·质粒DNA向大肠杆菌中的转化(热激法) | 第41页 |
| ·转化子鉴定 | 第41页 |
| ·植物表达载体向农杆菌中转化(电击法) | 第41-42页 |
| ·pHellsgate12系列表达载体构建 | 第42-48页 |
| ·GATEWAY技术的原理 | 第42-43页 |
| ·实验设计 | 第43-45页 |
| ·pHellsgate12系列载体构建路线 | 第45-46页 |
| ·PVY-CP基因反向重复结构目的片段的获得 | 第46页 |
| ·入门载体pDONR221和目的载体pHellsgate12的保存 | 第46页 |
| ·中间载体的获得 | 第46-47页 |
| ·pHellsgate12系列植物表达载体的获得 | 第47-48页 |
| ·植物表达载体向农杆菌中转化(电击法) | 第48页 |
| ·农杆菌渗入法(Agroinfiltration)介导的瞬时表达 | 第48-50页 |
| ·农杆菌制备步骤 | 第48-49页 |
| ·浸润 | 第49页 |
| ·病毒摩擦接种 | 第49页 |
| ·DAS-ELISA | 第49-50页 |
| 2 结果与分析 | 第50-56页 |
| ·pROKⅡ系列载体构建 | 第50-51页 |
| ·目的DNA片段的获得 | 第50-51页 |
| ·pUC19-Y451-750载体构建 | 第51页 |
| ·植物表达载体pR-Y451-750的构建 | 第51页 |
| ·pR-Y451-750向农杆菌中转化 | 第51页 |
| ·pHellsgate12系列表达载体构建 | 第51-54页 |
| ·PVY-CP基因反向重复结构目的片段的获得 | 第51-52页 |
| ·中间载体的获得 | 第52-53页 |
| ·pHellsgate12系列植物表达载体的获得 | 第53-54页 |
| ·pHellsgate12系列植物表达载体向农杆菌中转化 | 第54页 |
| ·农杆菌渗入法(Agroinfiltration)介导的瞬时表达 | 第54-56页 |
| ·瞬时表达后植物抗病性表现 | 第54页 |
| ·DAS-ELISA检测 | 第54-56页 |
| 3 讨论 | 第56-60页 |
| ·不同反向重复序列间隔区对抗病性的影响 | 第56-57页 |
| ·PVYCP基因序列差异对抗病毒的影响 | 第57-58页 |
| ·抗PVY的最短高效CP基因片段的探讨 | 第58-59页 |
| ·PVY-CP基因不同位置片段选择对抗病性的影响 | 第59-60页 |
| 4 结论 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-68页 |
| 攻读硕士期间论文发表情况 | 第68-69页 |
| 附录1 常用缓冲液及培养基的配制 | 第69-71页 |
| 附录2 | 第71-74页 |
| 附录3 不同限制性酶切体系 | 第74-75页 |
