高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒湖南株全长感染性cDNA克隆的构建
| 中文摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 前言 | 第10-11页 |
| 实验研究 | 第11-45页 |
| 1 材料 | 第11-16页 |
| ·毒株、质粒载体与细胞 | 第11页 |
| ·主要试剂和耗材 | 第11-12页 |
| ·主要仪器设备 | 第12-13页 |
| ·主要溶液的配制 | 第13-16页 |
| 2 方法 | 第16-38页 |
| ·目的DNA片段的扩增与克隆 | 第16-21页 |
| ·病毒RNA的制备 | 第17页 |
| ·目的DNA片段的RT-PCR扩增 | 第17-19页 |
| ·PCR产物的电泳与回收纯化 | 第19页 |
| ·PCR产物末端加A与回收纯化 | 第19-20页 |
| ·加A产物与质粒载体的连接 | 第20页 |
| ·连接产物的转化 | 第20页 |
| ·重组质粒的提取 | 第20-21页 |
| ·重组质粒DNA的定量 | 第21页 |
| ·重组质粒的酶切验证与序列测定 | 第21页 |
| ·连接载体的构建 | 第21-26页 |
| ·质粒载体的提取与定量 | 第21-24页 |
| ·质粒载体的双酶切 | 第24-25页 |
| ·酶切后质粒的回收纯化 | 第25页 |
| ·含多克隆位点双链DNA的合成 | 第25页 |
| ·双链DNA与质粒载体的连接 | 第25页 |
| ·连接产物的转化 | 第25页 |
| ·含多克隆位点重组质粒的提取与定量 | 第25页 |
| ·含多克隆位点重组质粒的单酶切鉴定与序列测定 | 第25-26页 |
| ·全长cDNA的连接与克隆 | 第26-35页 |
| ·双酶切含目的片段的重组质粒与连接载体 | 第32页 |
| ·酶切后小片段DNA的回收纯化 | 第32页 |
| ·酶切后大片段DNA的回收纯化 | 第32-33页 |
| ·目的DNA片段与质粒载体的连接 | 第33页 |
| ·连接产物的转化 | 第33页 |
| ·重组质粒的菌液PCR筛选 | 第33-34页 |
| ·重组质粒的STET法筛选 | 第34页 |
| ·重组质粒的提取与鉴定 | 第34-35页 |
| ·全长cDNA克隆的体外转录 | 第35-36页 |
| ·含全长cDNA克隆质粒的大量抽提 | 第35页 |
| ·含全长cDNA克隆质粒的浓缩 | 第35页 |
| ·重组质粒的酶切线性化与RNAase的去除 | 第35-36页 |
| ·RNA的体外转录与加帽反应 | 第36页 |
| ·病毒的拯救与检测 | 第36-38页 |
| ·体外转录RNA的脂质体转染 | 第36-37页 |
| ·盲传拯救的病毒 | 第37页 |
| ·拯救病毒的检测 | 第37-38页 |
| 3 结果与分析 | 第38-42页 |
| ·目的DNA片段的克隆与测序 | 第38页 |
| ·连接载体的构建 | 第38-42页 |
| ·pMCS1.1和pMCS2.1的单酶切鉴定 | 第38页 |
| ·pAC1.1的单酶切鉴定 | 第38-42页 |
| ·全长cDNA克隆的酶切鉴定 | 第42页 |
| ·全长cDNA克隆的体外转录 | 第42页 |
| ·拯救病毒的检测 | 第42页 |
| ·拯救病毒盲传结果 | 第42页 |
| ·拯救病毒的RT-PCR检测 | 第42页 |
| ·拯救病毒的免疫组织化学染色结果 | 第42页 |
| 4 讨论 | 第42-45页 |
| 结论 | 第45-46页 |
| 文献综述 | 第46-61页 |
| 1 PRRS病原学 | 第46-54页 |
| ·PRRSV的分类地位 | 第46-47页 |
| ·PRRSV的结构与理化特性 | 第47页 |
| ·PRRSV的生物学特性 | 第47-49页 |
| ·PRRSV在细胞中的增殖 | 第47页 |
| ·PRRSV的抗体依赖性增强作用 | 第47-48页 |
| ·PRRSV的血凝特性 | 第48页 |
| ·PRRSV的致病特性 | 第48-49页 |
| ·PRRSV的基因组与编码蛋白质 | 第49-54页 |
| ·PRRSV的基因组结构与功能 | 第49-50页 |
| ·PRRSV基因组的转录与表达 | 第50-51页 |
| ·PRRSV编码蛋白质的结构与功能 | 第51-54页 |
| 2 PRRS疫苗研究 | 第54-58页 |
| ·PRRS传统疫苗 | 第54-56页 |
| ·PRRS弱毒疫苗 | 第54-55页 |
| ·PRRS灭活疫苗 | 第55-56页 |
| ·PRRS新型疫苗 | 第56-57页 |
| ·PRRS亚单位疫苗 | 第56页 |
| ·PRRS核酸疫苗 | 第56页 |
| ·PRRS活载体疫苗 | 第56-57页 |
| ·PRRS疫苗研究中需关注的问题 | 第57-58页 |
| 3 反向遗传操作技术在PRRSV研究中的应用 | 第58-60页 |
| ·反向遗传操作技术在PRRSV研究中的策略 | 第58页 |
| ·PRRSV感染性克隆的构建方法 | 第58-59页 |
| ·PRRSV全长cDNA克隆的构建研究进展 | 第59-60页 |
| 4 结语 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-69页 |
| 附录1 | 第69-70页 |
| 附录2 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
