| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 1 前言 | 第11-23页 |
| ·文献综述 | 第11-22页 |
| ·常用的选择标记基因及特点 | 第11-12页 |
| ·EGFP—超级标记物 | 第12-13页 |
| ·GFP的来源、生化特性及其发光机理 | 第12页 |
| ·GFP的突变体 | 第12-13页 |
| ·GFP的细胞毒性 | 第13页 |
| ·选择标记基因的安全性问题 | 第13-14页 |
| ·标记基因的生物安全性评价研究进展 | 第14-16页 |
| ·标记基因的直接食品安全性 | 第14-15页 |
| ·标记基因编码蛋白的食品安全性 | 第15-16页 |
| ·标记基因的环境安全性 | 第16页 |
| ·转基因食品中标记基因的去除 | 第16页 |
| ·位点特异性重组系统 | 第16-21页 |
| ·位点特异性重组系统的结构及功能特点 | 第16-18页 |
| ·Cre/loxP系统的结构特点 | 第18-20页 |
| ·位点特异性重组酶Cre/loxP系统的应用 | 第20-21页 |
| ·核糖体内部进入位点概况 | 第21-22页 |
| ·研究的目的和意义 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-41页 |
| ·主要试剂 | 第23-25页 |
| ·质粒构建及PCR检测 | 第23页 |
| ·主要仪器 | 第23-24页 |
| ·主要试剂的配制 | 第24页 |
| ·质粒构建和PCR检测 | 第24页 |
| ·主要分析软件 | 第24-25页 |
| ·实验方法 | 第25-41页 |
| ·重组质粒骨架pMD-CreFlp的构建 | 第25-28页 |
| ·融合重组酶识别位点的生物合成 | 第25页 |
| ·融合重组酶识别位点的TA克隆 | 第25-27页 |
| ·pMD-CreFlp骨架载体质粒DNA的提取 | 第27-28页 |
| ·骨架载体中选择标记基因等元件的连入 | 第28-32页 |
| ·选择标记基因及相关元件的克隆 | 第29-30页 |
| ·载体质粒信息介绍 | 第30-32页 |
| ·转染用无内毒素质粒的提取 | 第32-33页 |
| ·转染用线性化质粒的制备 | 第33-34页 |
| ·线性化质粒 | 第33-34页 |
| ·线性化质粒的纯化 | 第34页 |
| ·细胞培养实验 | 第34-41页 |
| ·细胞培养基本操作 | 第34-35页 |
| ·G418筛选浓度确定试验 | 第35页 |
| ·转染细胞及G418筛选试验 | 第35页 |
| ·单克隆细胞的获得 | 第35-37页 |
| ·FRT重组酶删除实验 | 第37页 |
| ·转染重组酶质粒细胞删除效果的检测 | 第37-39页 |
| ·流式细胞仪检测细胞删除效果 | 第39-41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-53页 |
| ·含重组酶删除位点的骨架载体pMD-CreFlp构建 | 第41页 |
| ·载体骨架中选择标记基因及相关元件的连接 | 第41-42页 |
| ·转染用无内毒素质粒制备 | 第42-44页 |
| ·猪肾上皮细胞培养及重组酶删除质粒的转染结果 | 第44页 |
| ·单克隆细胞培养结果 | 第44-53页 |
| ·G418筛选浓度的确立 | 第44-46页 |
| ·单克隆细胞的筛选 | 第46页 |
| ·单克隆细胞的纯化与富集 | 第46-47页 |
| ·Flp重组酶质粒的转染,细胞总RNA提取及反转录结果 | 第47-48页 |
| ·荧光定量PCR检测 | 第48-51页 |
| ·流式细胞仪检测 | 第51-53页 |
| 4 讨论 | 第53-57页 |
| ·外源基因的有效删除 | 第53页 |
| ·删除试验细胞株的选择 | 第53-54页 |
| ·单克隆细胞的筛选 | 第54-55页 |
| ·筛选前G418浓度的确定 | 第54页 |
| ·加药时间和维持浓度 | 第54-55页 |
| ·筛选时的培养液 | 第55页 |
| ·单克隆细胞的纯化和富集 | 第55-56页 |
| ·影响重组酶删除试验的因素 | 第56-57页 |
| 5 结论 | 第57-58页 |
| 致谢 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-64页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第64页 |