| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 主要符号对照表 | 第17-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-36页 |
| 1.1 羊奶脂肪酸的营养价值 | 第18页 |
| 1.2 乳腺脂肪酸合成代谢调控 | 第18-20页 |
| 1.2.1 脂肪酸的从头合成 | 第18页 |
| 1.2.2 脂肪酸的延伸与去饱和 | 第18-20页 |
| 1.3 SCD1 基因研究进展 | 第20-23页 |
| 1.3.1 SCD1 基因的结构与亚型 | 第20页 |
| 1.3.2 SCD1 基因在生理代谢中的作用 | 第20-22页 |
| 1.3.3 SCD1 基因在反刍动物乳腺的功能 | 第22-23页 |
| 1.3.4 SCD1 基因的表达调控 | 第23页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9 基因编辑系统概述 | 第23-29页 |
| 1.4.1 CRISPR系统的发展 | 第23-25页 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9 系统的作用途径 | 第25-27页 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9 系统的脱靶效应 | 第27-29页 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 系统的应用 | 第29-32页 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9 系统应用于转录调控 | 第29-30页 |
| 1.5.2 sgRNA文库注释内源顺式作用元件及筛选功能基因 | 第30-31页 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9 系统应用于表观遗传学 | 第31页 |
| 1.5.4 单碱基编辑器 | 第31-32页 |
| 1.6 CRISPR/Cas9 系统在转基因动物生产中的应用 | 第32-35页 |
| 1.6.1 CRISPR/Cas9 技术应用于动物疾病模型 | 第32-33页 |
| 1.6.2 CRISPR/Cas9 技术应用于畜牧学生产 | 第33-35页 |
| 1.7 研究的目的与意义 | 第35-36页 |
| 第二章 山羊SCD1 基因sgRNA设计筛选与同源重组载体构建 | 第36-49页 |
| 2.1 材料与方法 | 第36-42页 |
| 2.1.1 试验材料 | 第36-37页 |
| 2.1.2 试验仪器设备 | 第37页 |
| 2.1.3 细胞培养及处理 | 第37页 |
| 2.1.4 山羊SCD1 基因sgRNA设计 | 第37-38页 |
| 2.1.5 sgRNA/Cas9 真核表达载体构建 | 第38-39页 |
| 2.1.6 乳腺上皮细胞嘌呤霉素最适浓度筛选 | 第39页 |
| 2.1.7 细胞转染及筛选 | 第39-40页 |
| 2.1.8 T7EN1 酶切检测打靶效率 | 第40-41页 |
| 2.1.9 同源重组载体构建 | 第41-42页 |
| 2.2 结果与分析 | 第42-45页 |
| 2.2.1 乳腺上皮细胞最适嘌呤霉素浓度确定 | 第42-43页 |
| 2.2.2 sgRNA基因编辑效率鉴定 | 第43-44页 |
| 2.2.3 sgRNA打靶突变类型分析 | 第44页 |
| 2.2.4 同源臂克隆 | 第44-45页 |
| 2.2.5 5 ’arm+EGFP+PURO+3’arm同源重组载体构建 | 第45页 |
| 2.3 讨论 | 第45-48页 |
| 2.3.1 sgRNA的设计与筛选 | 第45-46页 |
| 2.3.2 基因编辑效率影响因素 | 第46-47页 |
| 2.3.3 基于同源重组模板的HDR修复途径 | 第47-48页 |
| 2.4 小结 | 第48-49页 |
| 第三章 基于非同源末端连接修复(NHEJ)和同源导向修复(HDR)机制的SCD1 敲除乳腺上皮细胞的制备 | 第49-65页 |
| 3.1 材料与方法 | 第49-54页 |
| 3.1.1 试验材料 | 第49-50页 |
| 3.1.2 试验仪器设备 | 第50页 |
| 3.1.3 PX330-sgRNA载体构建 | 第50页 |
| 3.1.4 细胞转染及单克隆细胞筛选 | 第50-51页 |
| 3.1.5 单克隆细胞基因编辑情况检测 | 第51页 |
| 3.1.6 脱靶位点分析及检测 | 第51-52页 |
| 3.1.7 细胞培养及处理 | 第52页 |
| 3.1.8 RNA提取及RT-qPCR | 第52-53页 |
| 3.1.9 蛋白提取及Western Blot | 第53页 |
| 3.1.10 细胞免疫荧光 | 第53-54页 |
| 3.1.11 数据分析 | 第54页 |
| 3.2 结果与分析 | 第54-62页 |
| 3.2.1 NHEJ途径介导的SCD1 基因序列突变 | 第54-55页 |
| 3.2.2 PX330-sgRNA3 载体构建 | 第55页 |
| 3.2.3 HDR途径介导的SCD1 基因序列突变 | 第55-58页 |
| 3.2.4 SCD1 敲除乳腺上皮细胞脱靶位点分析 | 第58-60页 |
| 3.2.5 SCD1 敲除乳腺上皮细胞表达量分析 | 第60-62页 |
| 3.3 讨论 | 第62-64页 |
| 3.3.1 NHEJ与 HDR介导的DNA修复途径与基因编辑效率 | 第62-63页 |
| 3.3.2 CRISPR/Cas9 系统的脱靶效应 | 第63-64页 |
| 3.4 小结 | 第64-65页 |
| 第四章 山羊乳腺上皮细胞SCD1 基因敲除对脂肪酸代谢的影响研究 | 第65-75页 |
| 4.1 材料与方法 | 第65-66页 |
| 4.1.1 试验材料 | 第65页 |
| 4.1.2 试验仪器设备 | 第65页 |
| 4.1.3 甘油三酯和胆固醇含量测定 | 第65-66页 |
| 4.1.4 细胞脂肪酸成分测定 | 第66页 |
| 4.1.5 RNA提取及RT-qPCR | 第66页 |
| 4.1.6 蛋白提取及Western blot | 第66页 |
| 4.1.7 数据分析 | 第66页 |
| 4.2 结果与分析 | 第66-72页 |
| 4.2.1 SCD1 基因敲除对乳腺上皮细胞甘油三酯含量的影响 | 第66-67页 |
| 4.2.2 SCD1 基因敲除对乳腺上皮细胞胆固醇含量的影响 | 第67-68页 |
| 4.2.3 SCD1 基因敲除对乳腺上皮细胞脂肪酸含量的影响 | 第68-69页 |
| 4.2.4 SCD1 基因敲除对乳腺上皮细胞脂质合成相关基因的影响 | 第69-71页 |
| 4.2.5 SCD1 基因敲除对SREBP1 表达的影响 | 第71-72页 |
| 4.3 讨论 | 第72-74页 |
| 4.3.1 SCD1 基因敲除对脂肪酸合成及相关基因表达的影响 | 第72-73页 |
| 4.3.2 RNA干扰与CRISPR/Cas9 基因编辑技术 | 第73-74页 |
| 4.4 小结 | 第74-75页 |
| 第五章 小鼠受精卵SCD1 基因敲除研究 | 第75-88页 |
| 5.1 材料与方法 | 第75-80页 |
| 5.1.1 试验材料 | 第75页 |
| 5.1.2 仪器设备 | 第75-76页 |
| 5.1.3 小鼠受精卵分离培养 | 第76页 |
| 5.1.4 小鼠SCD1 基因sgRNA设计 | 第76-77页 |
| 5.1.5 小鼠SCD1 基因sgRNA体外转录载体构建 | 第77-78页 |
| 5.1.6 sgRNA体外转录 | 第78页 |
| 5.1.7 Cas9 mRNA体外转录 | 第78-79页 |
| 5.1.8 sgRNA体外切割试验 | 第79页 |
| 5.1.9 sgRNA与 Cas9 mRNA显微注射小鼠受精卵 | 第79-80页 |
| 5.1.10 小鼠胚胎基因组DNA提取及基因编辑情况检测 | 第80页 |
| 5.2 结果与分析 | 第80-85页 |
| 5.2.1 sgRNA与 Cas9 mRNA的体外转录 | 第80-81页 |
| 5.2.2 sgRNA体外切割试验 | 第81-82页 |
| 5.2.3 小鼠SCD1 基因sgRNA基因编辑效率 | 第82-84页 |
| 5.2.4 小鼠胚胎发育分析 | 第84-85页 |
| 5.3 讨论 | 第85-87页 |
| 5.3.1 小鼠胚胎应用于基因编辑技术改良模型 | 第85页 |
| 5.3.2 CRISPR/Cas9 系统应用于转基因小鼠研究 | 第85-86页 |
| 5.3.3 SCD1 敲除小鼠对脂质代谢的影响 | 第86-87页 |
| 5.4 小结 | 第87-88页 |
| 第六章 山羊孤雌激活胚胎SCD1 基因敲除研究 | 第88-100页 |
| 6.1 材料与方法 | 第88-92页 |
| 6.1.1 试验材料 | 第88-89页 |
| 6.1.2 仪器设备 | 第89页 |
| 6.1.3 山羊卵母细胞分离 | 第89页 |
| 6.1.4 山羊卵母细胞培养及体外成熟 | 第89页 |
| 6.1.5 山羊卵母细胞孤雌激活 | 第89页 |
| 6.1.6 山羊SCD1 基因sgRNA设计及筛选 | 第89-91页 |
| 6.1.7 山羊SCD1 基因sgRNA体外转录载体的构建 | 第91-92页 |
| 6.1.8 sgRNA及 Cas9 mRNA体外转录 | 第92页 |
| 6.1.9 sgRNA体外切割试验 | 第92页 |
| 6.1.10 sgRNA与 Cas9 mRNA显微注射山羊孤雌激活胚胎 | 第92页 |
| 6.1.11 孤雌激活胚胎基因组DNA提取及基因编辑检测 | 第92页 |
| 6.2 结果与分析 | 第92-97页 |
| 6.2.1 乳腺上皮细胞sgRNA打靶效率验证 | 第92-93页 |
| 6.2.2 sgRNA与 Cas9 mRNA的体外转录结果 | 第93-94页 |
| 6.2.3 sgRNA体外切割试验 | 第94页 |
| 6.2.4 SCD1 基因sgRNA基因编辑效率分析 | 第94-97页 |
| 6.2.5 山羊孤雌激活胚胎卵裂率分析 | 第97页 |
| 6.3 讨论 | 第97-99页 |
| 6.3.1 CRISPR/Cas9 技术应用于转基因动物胚胎基因编辑 | 第97-99页 |
| 6.3.2 显微注射技术应用于CRISPR/Cas9 介导的基因编辑 | 第99页 |
| 6.4 小结 | 第99-100页 |
| 结论 | 第100-101页 |
| 创新点 | 第101-102页 |
| 存在问题及展望 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-118页 |
| 附录 | 第118-123页 |
| 致谢 | 第123-125页 |
| 个人简历 | 第125页 |
