| 摘要 | 第7-8页 |
| 1 前言 | 第8-18页 |
| 1.1 基因组编辑技术 | 第8-14页 |
| 1.1.1 锌指核酸酶技术 | 第8-10页 |
| 1.1.2 类转录激活因子效应物核酸酶技术 | 第10-12页 |
| 1.1.3 CRISPR-Cas9技术 | 第12-14页 |
| 1.2 CRISPR-Cas9系统在植物基因编辑中的应用 | 第14-16页 |
| 1.2.1 单基因及多基因敲除 | 第14-15页 |
| 1.2.2 基因插入和定点替换 | 第15页 |
| 1.2.3 Cas9失活酶和切口酶的应用 | 第15页 |
| 1.2.4 植物基因组单碱基编辑 | 第15-16页 |
| 1.2.5 DNA-free植物基因组编辑系统 | 第16页 |
| 1.3 CRISPR-VQR系统 | 第16-17页 |
| 1.3.1 原始的CRISPR-VQR系统 | 第17页 |
| 1.3.2 改进后的CRISPR-VQR系统 | 第17页 |
| 1.4 研究的目的和意义 | 第17-18页 |
| 2 材料与方法 | 第18-25页 |
| 2.1 试验材料 | 第18-19页 |
| 2.1.1 材料与载体 | 第18页 |
| 2.1.2 培养基和试剂的配制 | 第18-19页 |
| 2.2 试验方法 | 第19-25页 |
| 2.2.1 水稻叶片DNA的提取 | 第20页 |
| 2.2.2 质粒的提取 | 第20页 |
| 2.2.3 PCR扩增 | 第20-21页 |
| 2.2.4 酶切反应体系 | 第21-22页 |
| 2.2.5 DNA片段的回收 | 第22页 |
| 2.2.6 DNA片段的连接 | 第22页 |
| 2.2.7 原生质体转化 | 第22页 |
| 2.2.8 感受态的制备 | 第22-23页 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态的热击转化 | 第23页 |
| 2.2.10 菌落PCR | 第23-24页 |
| 2.2.11 菌种保存 | 第24页 |
| 2.2.12 质粒保存 | 第24页 |
| 2.2.13 测序峰图的解读 | 第24页 |
| 2.2.14 靶点序列选择的基本原则及引物设计 | 第24页 |
| 2.2.15 PCR/RE试验 | 第24页 |
| 2.2.16 转基因植株的获得 | 第24-25页 |
| 3 试验结果分析 | 第25-33页 |
| 3.1 利用VQR基因组编辑系统对NAL1和LPA1基因高效编辑 | 第25-27页 |
| 3.1.1 NAL1-Q1、NAL1-Q2和LPA1-Q靶位点的选择 | 第25页 |
| 3.1.2 NAL1-Q1、NAL1-Q2和LPA1-Q靶位点基因编辑载体的构建 | 第25-26页 |
| 3.1.3 转基因植株的筛选与鉴定 | 第26页 |
| 3.1.4 测序结果分析 | 第26-27页 |
| 3.2 VQR高效识别NGAC PAM序列 | 第27-31页 |
| 3.2.1 GL1-C和NAL1-C靶点的选择 | 第27-28页 |
| 3.2.2 GL1-C和NAL1-C靶点的基因编辑载体构建 | 第28-29页 |
| 3.2.3 水稻原生质体转化验证基因编辑效率 | 第29页 |
| 3.2.4 转基因植株的筛选与鉴定 | 第29页 |
| 3.2.5 测序结果分析 | 第29-31页 |
| 3.3 突变类型分析 | 第31页 |
| 3.4 SpCas9低效识别NGA PAM | 第31-33页 |
| 3.4.1 NAL1-C和GL1-C靶位点的选择 | 第31-32页 |
| 3.4.2 NAL1-C和GL1-C靶位点基因编辑载体的构建 | 第32页 |
| 3.4.3 测序结果的统计分析 | 第32-33页 |
| 4 讨论 | 第33-36页 |
| 4.1 改进的CRISPR-VQR系统使基因编辑效率显著提高 | 第33页 |
| 4.2 VQR识别NGAC PAM的意义 | 第33-34页 |
| 4.3 SpCas9识别NGA PAM能力评估的方式 | 第34页 |
| 4.4 VQR产生双等位突变的价值 | 第34页 |
| 4.5 原生质体转化试验的便捷性 | 第34-36页 |
| 5 全文结论 | 第36-37页 |
| 参考文献 | 第37-40页 |
| Abstract | 第40-41页 |
| 附录 | 第42-56页 |
| 致谢 | 第56页 |
