| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 缩写 | 第7-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-16页 |
| 1.1 烟碱类杀虫剂吡虫啉的研究背景 | 第11-14页 |
| 1.2 吡虫啉羟基化途径代谢机制的研究 | 第14-16页 |
| 第二章 E.coli DH10B共代谢转化IMI及其产物鉴定 | 第16-23页 |
| 1 实验材料 | 第16-17页 |
| 1.1 培养基 | 第16页 |
| 1.2 主要试剂及来源 | 第16页 |
| 1.3 主要仪器设备及来源 | 第16-17页 |
| 2 实验方法 | 第17-18页 |
| 2.1 E.coli DH10B的培养 | 第17页 |
| 2.2 E.coli DH10B静息细胞的制备和转化 | 第17页 |
| 2.3 HPLC和LC/MS分析 | 第17-18页 |
| 2.4 E.coli DH10B静息细胞转化IMI的动力学曲线 | 第18页 |
| 3 实验结果 | 第18-22页 |
| 3.1 E.coli DH10B静息细胞转化IMI | 第18-19页 |
| 3.2 LC/MS分析 | 第19-21页 |
| 3.3 E.coli DH10B静息细胞转化IMI的动力学曲线 | 第21页 |
| 3.4 三种IMI羟基化菌株的IMI代谢能力比较 | 第21-22页 |
| 4 讨论 | 第22-23页 |
| 第三章 E. coli DH10B中羟基化酶基因敲除和克隆表达 | 第23-50页 |
| 第一节 E.coli DH10B单加氧酶基因的敲除及其IMI羟基化功能检测 | 第23-35页 |
| 1 实验材料 | 第23-25页 |
| 1.1 主要试剂及来源相关试剂的配制 | 第23页 |
| 1.2 培养基 | 第23-24页 |
| 1.3 主要仪器设备及来源 | 第24页 |
| 1.4 菌种和质粒 | 第24-25页 |
| 2 实验方法 | 第25-31页 |
| 2.1 菌体的培养和保藏 | 第25页 |
| 2.2 羟基化酶基因敲除 | 第25-30页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第25-29页 |
| 2.2.1.1 同源臂引物设计 | 第25-27页 |
| 2.2.1.2 验证引物设计 | 第27-29页 |
| 2.2.2 同源臂扩增 | 第29页 |
| 2.2.2.1 PCR体系及条件 | 第29页 |
| 2.2.2.2 PCR产物纯化回收 | 第29页 |
| 2.2.3 Red重组系统的诱导和E.coli DH10B/pSC101电转感受态细胞的制备 | 第29-30页 |
| 2.2.4 电转化 | 第30页 |
| 2.3 重组菌株的鉴定 | 第30-31页 |
| 2.4 测序 | 第31页 |
| 2.5 敲除相应基因的E. coli DH10B静息细胞转化IMI | 第31页 |
| 3 实验结果 | 第31-34页 |
| 3.1 同源臂PCR扩增 | 第31-32页 |
| 3.2 验证片段PCR | 第32页 |
| 3.3 敲除相应基因的E.coli DH10B静息细胞转化IMI的活性检测 | 第32-34页 |
| 4 讨论 | 第34-35页 |
| 第二节 E.coli DH10B中羟基化酶基因ubiB,ubiF和ubiH的克隆表达及IMI羟基化活性检测 | 第35-50页 |
| 1 实验材料 | 第35-36页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第35页 |
| 1.2 主要试剂及来源 | 第35-36页 |
| 1.3 主要仪器设备及其来源 | 第36页 |
| 1.4 培养基和主要溶液配制 | 第36页 |
| 2 实验方法 | 第36-43页 |
| 2.1 菌株培养 | 第36-37页 |
| 2.2 基因组DNA的提取 | 第37页 |
| 2.3 设计引物进行PCR扩增 | 第37-38页 |
| 2.4 PCR产物纯化回收 | 第38页 |
| 2.5 PCR产物TA克隆 | 第38页 |
| 2.6 大肠杆菌感受态细胞制备及转化 | 第38-39页 |
| 2.7 菌落PCR验证阳性克隆 | 第39页 |
| 2.8 测序验证 | 第39页 |
| 2.9 制备含粘性末端的DNA片段和pET-28a载体 | 第39-40页 |
| 2.10 构建表达载体并将载体转化至表达菌株E.coli Rosetta | 第40-41页 |
| 2.11 ubiB、ubiF和ubiH蛋白的诱导表达 | 第41页 |
| 2.12 SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况 | 第41-43页 |
| 2.13 HPLC分析羟基化酶活性 | 第43页 |
| 3 实验结果 | 第43-49页 |
| 3.1 E.coli DH10B中ubiF、ubiH、ubiB基因的PCR扩增 | 第43-44页 |
| 3.2 阳性克隆的筛选结果 | 第44页 |
| 3.3 测序序列比对结果 | 第44页 |
| 3.4 目的片段连pET28a表达载体 | 第44-47页 |
| 3.5 目的基因诱导表达SDS-PAGE电泳结果 | 第47-48页 |
| 3.6 表达菌株羟基化酶活性检测结果 | 第48-49页 |
| 4 讨论 | 第49-50页 |
| 第四章 E.coliDH10B和S.maltophilia CGMCC 1.1788的5-hydroxy IMI脱水酶的分离纯化 | 第50-61页 |
| 第一节 E.coli DH10B中5-hydroxy IMI脱水酶的分离纯化 | 第50-56页 |
| 1 材料和方法 | 第50-52页 |
| 1.1 实验材料 | 第50页 |
| 1.2 E.coli DH10B菌株的培养 | 第50页 |
| 1.3 高压破碎 | 第50-52页 |
| 2 结果分析 | 第52-55页 |
| 3 讨论 | 第55-56页 |
| 第二节 S. maltophilia CGMCC 1 .1788中5-hydroxy IMI脱水酶的分离纯化 | 第56-61页 |
| 1 材料和方法 | 第56-57页 |
| 1.1 实验材料 | 第56页 |
| 1.2 S.maltophilia CGMCC 1.1788的培养 | 第56页 |
| 1.3 高压破碎 | 第56-57页 |
| 2 结果分析 | 第57-60页 |
| 3 讨论 | 第60-61页 |
| 总结 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-68页 |
| 在读研究生期间主要科研情况 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
