| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一部分 文献综述 | 第11-19页 |
| 1.噬菌体展示技术及其制备纳米抗体的研究现状 | 第11-16页 |
| 1.1 噬菌体展示技术的原理 | 第12页 |
| 1.2 纳米抗体的特点及应用 | 第12-15页 |
| 1.3 借助噬菌体展示技术来制备抗靶蛋白的纳米抗体 | 第15-16页 |
| 2.磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)结构及应用 | 第16-18页 |
| 2.1 GPC3基因结构特点 | 第16-17页 |
| 2.2 GPC3蛋白的应用 | 第17-18页 |
| 3.研究目的及意义 | 第18-19页 |
| 第二部分 实验部分 | 第19-66页 |
| 第一章 人GPC3基因的原核表达及纯化 | 第19-32页 |
| 1.材料和试剂 | 第20-21页 |
| 1.1 实验菌株、载体和实验动物 | 第20页 |
| 1.2 实验试剂 | 第20-21页 |
| 2.实验方法 | 第21-27页 |
| 2.1 重组载体的构建 | 第21页 |
| 2.2 人GPC3基因的引物设计 | 第21页 |
| 2.3 人GPC3基因的PCR扩增及纯化 | 第21-22页 |
| 2.4 构建pET28a-GPC3重组质粒 | 第22-24页 |
| 2.5 融合蛋白His-GPC3的诱导表达及WesternBlot鉴定 | 第24-27页 |
| 2.5.1 融合蛋白His-GPC3的诱导表达及优化 | 第24-25页 |
| 2.5.2 融合蛋白His-GPC3的检测 | 第25页 |
| 2.5.3 融合蛋白His-GPC3的Western Blot鉴定 | 第25-26页 |
| 2.5.4 人His-GPC3融合蛋白的获得 | 第26页 |
| 2.5.5 人His-GPC3融合蛋白的纯化 | 第26-27页 |
| 3.实验结果 | 第27-30页 |
| 3.1 构建原核表达载体pET28a-GPC | 第27页 |
| 3.2 融合蛋白His-GPC3的诱导表达及优化 | 第27-29页 |
| 3.3 His-GPC3融合蛋白的纯化 | 第29-30页 |
| 4.讨论 | 第30-32页 |
| 第二章 GPC3基因的结构与功能生物信息学预测 | 第32-41页 |
| 1.材料与方法 | 第33-34页 |
| 1.1 一般材料 | 第33页 |
| 1.2 方法 | 第33-34页 |
| 2.结果与分析 | 第34-39页 |
| 2.1 GPC3基因编码产物分析 | 第34页 |
| 2.2 GPC3基因理化性质分析 | 第34页 |
| 2.3 GPC3信号肽分析 | 第34-35页 |
| 2.4 GPC3跨膜结构分析 | 第35-36页 |
| 2.5 GPC3蛋白二级结构分析 | 第36页 |
| 2.6 GPC3蛋白翻译后修饰位点分析 | 第36-37页 |
| 2.7 GPC3蛋白亚细胞定位及B细胞线性表位分析 | 第37-38页 |
| 2.8 精氨酸和赖氨酸裂解位点分析 | 第38页 |
| 2.9 GPC3蛋白三维结构预测 | 第38-39页 |
| 2.10 GPC3蛋白相互作用分析 | 第39页 |
| 3.讨论 | 第39-41页 |
| 第三章 新疆双峰驼噬菌体展示文库的构建及筛选 | 第41-56页 |
| 1.实验材料方法 | 第42-44页 |
| 2.实验步骤 | 第44-50页 |
| 2.1 骆驼免疫 | 第44页 |
| 2.2 免疫双峰驼血清中GPC3抗体水平检测 | 第44页 |
| 2.3 骆驼脾脏组织RNA的提取 | 第44页 |
| 2.4 逆转录cDNA及目的片段的扩增 | 第44-46页 |
| 2.5 目的片段和载体的制备 | 第46-47页 |
| 2.6 目的基因与载体连接 | 第47页 |
| 2.7 大肠杆菌TG1电转化感受态细胞的制备及连接产物转化 | 第47-48页 |
| 2.8 建库 | 第48页 |
| 2.9 辅助噬菌体扩增及滴度测定 | 第48-49页 |
| 2.10 VHH噬菌体展示文库的表达及分离 | 第49页 |
| 2.11 噬菌体展示文库的滴度测定 | 第49页 |
| 2.12 噬菌体展示文库的筛选 | 第49-50页 |
| 3.实验结果 | 第50-54页 |
| 3.1 双峰驼抗GPC3血清滴度检测 | 第50页 |
| 3.2 双峰驼脾脏组织RNA的提取 | 第50-51页 |
| 3.3 目的片段IgG2a的PCR扩增及阳性克隆双酶切鉴定 | 第51页 |
| 3.4 抗体库库容量的测定 | 第51页 |
| 3.5 M13KO7辅助噬菌体滴度的测定 | 第51-52页 |
| 3.6 噬菌体展示文库滴度的测定 | 第52页 |
| 3.7 噬菌体展示文库筛选 | 第52-54页 |
| 4.讨论 | 第54-56页 |
| 第四章 抗GPC3纳米抗体的制备及对肝癌细胞靶向识别效应初探 | 第56-66页 |
| 1.实验材料 | 第57-58页 |
| 1.1 菌种及质粒 | 第57页 |
| 1.2 引物与试剂 | 第57-58页 |
| 2.方法 | 第58-59页 |
| 2.1 pET28a-VHH_(GPC3)原核表达载体的构建 | 第58页 |
| 2.2 VHH_(GPC3)纳米抗体的原核表达及纯化 | 第58页 |
| 2.3 VHH_(GPC3)纳米抗体亲和力的测定 | 第58-59页 |
| 3.结果与分析 | 第59-63页 |
| 3.1 pET28a-VHH-(GPC3)原核表达载体的构建 | 第59-60页 |
| 3.2 VHH_(GPC3)纳米抗体的原核表达及纯化 | 第60-61页 |
| 3.3 VHH_(GPC3)纳米抗体的亲和力分析 | 第61-63页 |
| 4.讨论 | 第63-66页 |
| 第三部分 结论与展望 | 第66-67页 |
| 1.结论 | 第66页 |
| 2.展望 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 个人简历 | 第78-79页 |
