| 摘要 | 第3-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 第1章 引言 | 第10-21页 |
| 1.1 研究目的及意义 | 第10-11页 |
| 1.2 研究背景 | 第11-20页 |
| 1.2.1 腺相关病毒概述 | 第11-13页 |
| 1.2.2 腺相关病毒受体 | 第13-14页 |
| 1.2.3 腺相关病毒载体的临床应用 | 第14页 |
| 1.2.4 AAV的分离纯化技术 | 第14-18页 |
| 1.2.5 表面展示技术 | 第18-20页 |
| 1.3 研究内容 | 第20页 |
| 1.4 研究方法 | 第20页 |
| 1.5 论文结构 | 第20-21页 |
| 第2章 表面展示AAVR的融合载体的构建 | 第21-41页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-23页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第21页 |
| 2.1.2 试剂 | 第21-22页 |
| 2.1.3 仪器设备 | 第22页 |
| 2.1.4 培养基 | 第22-23页 |
| 2.1.5 试剂配置 | 第23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-33页 |
| 2.2.1 人正常肝细胞L02总RNA提取 | 第23-24页 |
| 2.2.2 总RNA逆转录 | 第24页 |
| 2.2.3 信号肽及跨膜区序列分析 | 第24-25页 |
| 2.2.4 引物设计 | 第25-26页 |
| 2.2.5 PCR扩增AAVR目的基因 | 第26-29页 |
| 2.2.6 AAVR目的基因的回收 | 第29页 |
| 2.2.7 PYD1质粒的提取 | 第29-30页 |
| 2.2.8 AAVR目的基因与PYD1质粒的双酶切 | 第30-32页 |
| 2.2.9 酶切产物的琼脂糖电泳与回收 | 第32页 |
| 2.2.10 酶切产物的连接构建AAVR-PYD1重组载体 | 第32页 |
| 2.2.11 E.coliDH5α感受态细胞的制备 | 第32-33页 |
| 2.2.12 目的质粒转化大肠杆菌 | 第33页 |
| 2.2.13 菌落PCR鉴定阳性克隆 | 第33页 |
| 2.2.14 重组载体AAVR-PYD1的提取 | 第33页 |
| 2.2.15 重组载体AAVR-PYD1的PCR验证 | 第33页 |
| 2.2.16 重组载体AAVR-PYD1的双酶切验证 | 第33页 |
| 2.3 结果与分析 | 第33-39页 |
| 2.3.1 AAVR目的基因提取 | 第33-34页 |
| 2.3.2 PYD1质粒的提取 | 第34-35页 |
| 2.3.3 PKD目的基因与PYD1质粒的双酶切 | 第35-36页 |
| 2.3.4 菌落PCR鉴定阳性克隆 | 第36-37页 |
| 2.3.5 重组载体PKD-PYD1和APKD-PYD1的提取 | 第37页 |
| 2.3.6 重组载体PKD-PYD1的PCR验证 | 第37-38页 |
| 2.3.7 重组载体PKD-PYD1的双酶切验证 | 第38-39页 |
| 2.3.8 PKD-PYD1质粒的测序结果 | 第39页 |
| 2.4 讨论与小结 | 第39-41页 |
| 第3章 腺相关病毒受体AAVR在酿酒酵母细胞表面的展示 | 第41-55页 |
| 3.1 实验材料 | 第41-42页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第41页 |
| 3.1.2 试剂配置 | 第41页 |
| 3.1.3 培养基 | 第41-42页 |
| 3.1.4 仪器设备 | 第42页 |
| 3.1.5 其他 | 第42页 |
| 3.2 实验方法 | 第42-49页 |
| 3.2.1 酿酒酵母EBY100的活化扩大培养与检测 | 第42-43页 |
| 3.2.2 酿酒酵母EBY100感受态的制备 | 第43页 |
| 3.2.3 重组载体PKD-PYD1电转化导入酿酒酵母EBY100感受态电转化 | 第43-44页 |
| 3.2.4 酿酒酵母阳性转化子的菌落PCR鉴定 | 第44页 |
| 3.2.5 酿酒酵母阳性转化子中提取PKD-PYD1质粒 | 第44-45页 |
| 3.2.6 提取PKD-PYD1质粒的PCR鉴定 | 第45页 |
| 3.2.7 表面展示AAVR的酿酒酵母的表达 | 第45-46页 |
| 3.2.8 BCA测定不同表达时间与温度对酿酒酵母展示蛋白的表达影响 | 第46页 |
| 3.2.9 酿酒酵母表达期间酵母总RNA的提取 | 第46-47页 |
| 3.2.10 酿酒酵母表达期间酵母总RNA的逆转录 | 第47页 |
| 3.2.11 总RNA的逆转录后cDNA的PCR验证 | 第47页 |
| 3.2.12 酵母细胞壁蛋白提取与浓缩 | 第47页 |
| 3.2.13 酵母细胞壁蛋白SDS-PAGE电泳及银染 | 第47-48页 |
| 3.2.14 酵母细胞免疫荧光检测 | 第48-49页 |
| 3.3 结果与分析 | 第49-53页 |
| 3.3.1 酿酒酵母阳性转化子的菌落PCR | 第49页 |
| 3.3.2 从酵母提取的PKD-PYD1以及PYD1质粒和PCR鉴定 | 第49-50页 |
| 3.3.3 不同表达时间对酿酒酵母展示蛋白的表达影响 | 第50-51页 |
| 3.3.4 总RNA的逆转录后cDNA的PCR验证 | 第51-52页 |
| 3.3.5 酵母细胞壁蛋白SDS-PAGE电泳及银染结果 | 第52页 |
| 3.3.6 酵母细胞免疫荧光检测结果 | 第52-53页 |
| 3.4 讨论与小结 | 第53-55页 |
| 第4章 表面展示AAVR的酿酒酵母对AAV的吸附及洗脱效果 | 第55-72页 |
| 4.1 实验材料 | 第55页 |
| 4.1.1 病毒、菌株与引物 | 第55页 |
| 4.2 实验方法 | 第55-63页 |
| 4.2.1 孵育温度对AAV的吸附影响 | 第55-56页 |
| 4.2.2 孵育时间对AAV的吸附影响 | 第56-57页 |
| 4.2.3 洗脱液不同离子浓度对AAV的洗脱情况 | 第57-58页 |
| 4.2.4 表达时间对AAV的吸附影响 | 第58-59页 |
| 4.2.5 酵母数量对AAV的吸附影响 | 第59-60页 |
| 4.2.6 表面展示AAVR的酿酒酵母对多种血清型AAV的吸附效果 | 第60-61页 |
| 4.2.7 不同pH对AAV的洗脱情况 | 第61-62页 |
| 4.2.8 多种洗脱液对AAV的洗脱情况对比 | 第62-63页 |
| 4.3 结果与分析 | 第63-70页 |
| 4.3.1 孵育温度对AAV的吸附影响 | 第63页 |
| 4.3.2 不同孵育时间对AAV的吸附影响结果 | 第63-64页 |
| 4.3.3 洗脱液不同离子浓度对AAV的洗脱情况 | 第64-65页 |
| 4.3.4 不同表达时间对AAV的吸附影响结果 | 第65-66页 |
| 4.3.5 酵母数量对AAV的吸附影响情况 | 第66-67页 |
| 4.3.6 表面展示AAVR的酿酒酵母对多种血清型AAV的吸附效果 | 第67-68页 |
| 4.3.7 不同pH对AAV的洗脱情况 | 第68-69页 |
| 4.3.8 不同洗脱液与多种洗脱液对AAV的洗脱情况 | 第69-70页 |
| 4.4 讨论与小结 | 第70-72页 |
| 第5章 结论 | 第72-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 致谢 | 第81-83页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第83页 |
