| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 绪论 | 第20-34页 |
| 1.1 聚羟基脂肪酸酯(PHA)简介 | 第20-21页 |
| 1.1.1 PHA基本介绍 | 第20页 |
| 1.1.2 PHA分类 | 第20-21页 |
| 1.1.3 PHA特性及应用 | 第21页 |
| 1.2 合成PHA的微生物 | 第21-22页 |
| 1.3 PHA的合成方法 | 第22-24页 |
| 1.3.1 化学合成法 | 第22-23页 |
| 1.3.2 PHA生物合成法 | 第23-24页 |
| 1.4 P3HP生物合成研究进展 | 第24-26页 |
| 1.5 PduP——辅酶A依赖的醛脱氢酶 | 第26-28页 |
| 1.6 PHA合酶 | 第28-29页 |
| 1.7 PHA提取与检测 | 第29-32页 |
| 1.8 本课题研究的意义 | 第32-34页 |
| 第二章 PHA合酶克隆与表达——代谢途径构建 | 第34-54页 |
| 2.1 引言 | 第34页 |
| 2.2 实验材料 | 第34-35页 |
| 2.2.1 菌株与载体 | 第35页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第35页 |
| 2.2.3 培养基 | 第35页 |
| 2.3 两种小同来源PHA合酶重组菌构建 | 第35-40页 |
| 2.3.1 R.eutropha、Synechocystis sp.基因组的提取 | 第36页 |
| 2.3.2 两种PHA合酶基因的扩增 | 第36-37页 |
| 2.3.3 琼脂糖电泳检测 | 第37页 |
| 2.3.4 pET-pk-phaC1与pET-pk-phbC载体构建 | 第37-38页 |
| 2.3.5 pET-pk-phaC1与pET-pk-phbC重组子鉴定 | 第38-40页 |
| 2.3.6 K.p(pET-pk-phaC1)与K p(pET-pk-phbC)重组菌构建及鉴定 | 第40页 |
| 2.4 重组菌的发酵及代谢物检测 | 第40-42页 |
| 2.4.1 发酵条件 | 第40页 |
| 2.4.2 生物量测定 | 第40-41页 |
| 2.4.3 甘油剩余量测定 | 第41页 |
| 2.4.4 相关代谢物测定 | 第41页 |
| 2.4.5 P3HP的提取 | 第41-42页 |
| 2.4.6 P3HP的GC-MS检测 | 第42页 |
| 2.5 结果与讨论 | 第42-52页 |
| 2.5.1 基因组提取结果 | 第42-43页 |
| 2.5.2 phaC1与phbC基因扩增结果 | 第43页 |
| 2.5.3 pET-pk-phaC1与pET-pk-phbC载体验证 | 第43-45页 |
| 2.5.4 重组菌K. p(pET-pk-phaC1)与K. p(pET-pk-phbC)验证 | 第45-46页 |
| 2.5.5 重组菌生物量比较 | 第46页 |
| 2.5.6 甘油剩余量比较 | 第46-47页 |
| 2.5.7 相关代谢物分析 | 第47-51页 |
| 2.5.8 P3HP的检测结果 | 第51-52页 |
| 2.6 本章小结 | 第52-54页 |
| 第三章 同源/异源表达PduP——前体物途径强化 | 第54-70页 |
| 3.1 引言 | 第54页 |
| 3.2 实验材料 | 第54页 |
| 3.2.1 菌株与载体 | 第54页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第54页 |
| 3.2.3 培养基 | 第54页 |
| 3.3 两种不同来源pduP重组菌构建 | 第54-57页 |
| 3.3.1 肺炎克雷伯氏菌基因组的提取 | 第55页 |
| 3.3.2 基因pduP_(Kp)和pduP_(Se)的扩增 | 第55-56页 |
| 3.3.3 pET-pk-pduP_(Kp)和pET-pk-pduP_(Se)载体构建 | 第56页 |
| 3.3.4 pET-pk-pduP_(Kp)和pET-pk-pduP_(Se)重组子鉴定 | 第56-57页 |
| 3.3.5 K.p(pET-pk-pduP_(Kp)、K. p(pET-pk-pduP_(Se))重组菌构建及鉴定 | 第57页 |
| 3.4 重组菌PduP表达及酶活测定 | 第57-59页 |
| 3.4.1 发酵条件 | 第57页 |
| 3.4.2 SDS-PAGE | 第57-58页 |
| 3.4.3 重组菌中PduP_(Se)酶活测定 | 第58-59页 |
| 3.5 发酵及相关代谢物测定 | 第59页 |
| 3.5.1 生物量测定 | 第59页 |
| 3.5.2 相关代谢物测定 | 第59页 |
| 3.6 结果与讨论 | 第59-69页 |
| 3.6.1 基因组和质粒 | 第59-60页 |
| 3.6.2 pduP基因的扩增 | 第60页 |
| 3.6.3 重组子pET-pk-pduP_(Kp)和pET-pk-pduP_(Se)验证 | 第60-61页 |
| 3.6.4 重组菌K. p(pET-pk-pduP_(Kp))和K. p(pET-pk-pduP_(Se))验证 | 第61-62页 |
| 3.6.5 重组菌SDS-PAGE电泳结果 | 第62-63页 |
| 3.6.6 重组菌PduP_(Se)酶活测定结果 | 第63页 |
| 3.6.7 生物量与甘油消耗测定结果 | 第63-65页 |
| 3.6.8 相关代谢物测定结果 | 第65-69页 |
| 3.7 本章小结 | 第69-70页 |
| 第四章 P3HP重组菌构建及发酵检测 | 第70-84页 |
| 4.1 引言 | 第70页 |
| 4.2 实验材料 | 第70-71页 |
| 4.2.1 菌株载体 | 第70-71页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第71页 |
| 4.2.3 培养基 | 第71页 |
| 4.3 重组子pET-pk-pduP_(Se)-phaC1的构建 | 第71-72页 |
| 4.3.1 pET-pk-pduP_(Se)-phaC1构建 | 第72页 |
| 4.3.2 重组子pET-pk-pduP_(Se)-phaC1鉴定 | 第72页 |
| 4.4 重组子pET-pk-pduP_(Se)-phbC的构建及鉴定 | 第72-73页 |
| 4.5 重组菌K. p(pET-pk-pduP_(Se)-phaC1)和K.p(pET-pk-pduP_(Se)-phbC)构建及鉴定 | 第73页 |
| 4.6 重组菌K. p(pET-pk-pduP_(Se)-phaC1)和K. p(pET-pk-pduP_(Se)-phbC)发酵 | 第73-74页 |
| 4.6.1 生物量测定 | 第74页 |
| 4.6.2 甘油消耗量测定 | 第74页 |
| 4.6.3 代谢物测定 | 第74页 |
| 4.6.4 P3HP检测 | 第74页 |
| 4.7 结果与讨论 | 第74-82页 |
| 4.7.1 重组子pET-pk-pduP_(Se)-phaC1验证结果 | 第74-75页 |
| 4.7.2 重组子pET-pk-pduP_(Se)-phbC验证结果 | 第75-76页 |
| 4.7.3 重组菌K. p(pET-pk-pduP_(Se)-phaC1)、K. p(pET-pk-pduP_(Se)-phbC)验证结果 | 第76-77页 |
| 4.7.4 生物量结果分析 | 第77-78页 |
| 4.7.5 甘油消耗测定结果 | 第78-79页 |
| 4.7.6 代谢物测定结果 | 第79-81页 |
| 4.7.7 P3HP测定结果 | 第81-82页 |
| 4.8 本章小结 | 第82-84页 |
| 第五章 P3HP工程代谢调控研究 | 第84-94页 |
| 5.1 引言 | 第84页 |
| 5.2 实验材料 | 第84-85页 |
| 5.2.1 菌株载体 | 第84页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第84页 |
| 5.2.3 培养基 | 第84-85页 |
| 5.3 分支途径敲除研究 | 第85-86页 |
| 5.3.1 重组质粒提取 | 第85页 |
| 5.3.2 宿主菌感受态细胞的制备 | 第85页 |
| 5.3.3 重组子电转化 | 第85页 |
| 5.3.4 电转化结果验证 | 第85-86页 |
| 5.3.5 重组菌发酵 | 第86页 |
| 5.4 高效启动子置换 | 第86-87页 |
| 5.4.1 tac启动子扩增 | 第86页 |
| 5.4.2 重组子pET-pk-pduP_(Se)-phaC1,pET-pk-pduP_(Se)-phbC启动子置换 | 第86-87页 |
| 5.4.3 重组菌K. p(pET-tac-pduP_(Se)-phaC1),K. p(pET-tac-pduP_(Se)-phbC)蛋白表达 | 第87页 |
| 5.5 结果与讨论 | 第87-92页 |
| 5.5.1 重组菌K. p(pET-tac-pduP_(Se)-phaC1-△dhaT),K.p(pET-tac-pduP_(Se)-phbC-△dhaT)验证 | 第87-88页 |
| 5.5.2 生物量比较 | 第88-89页 |
| 5.5.3 甘油剩余量比较 | 第89页 |
| 5.5.4 置换启动子验证 | 第89-90页 |
| 5.5.5 重组菌K. p(pET-tac-pduP_(Se)-phaC1),K. p(pET-tac-pduP_(Se)-phbC)的SDS-PAGE | 第90-92页 |
| 5.6 本章小结 | 第92-94页 |
| 第六章 课题总结 | 第94-96页 |
| 6.1 课题总结 | 第94-95页 |
| 6.2 创新点 | 第95页 |
| 6.3 问题与建议 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-102页 |
| 附录表1 试剂 | 第102-104页 |
| 附录表2 仪器 | 第104-106页 |
| 致谢 | 第106-108页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第108-110页 |
| 作者和导师简介 | 第110-111页 |
| 附件 | 第111-112页 |
