| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 绪论 | 第16-32页 |
| 1.1 谷胱甘肤概述 | 第16-21页 |
| 1.1.1 谷胱甘肽的分子结构与性质 | 第16-17页 |
| 1.1.2 谷胱甘肽的生理功能与应用 | 第17-19页 |
| 1.1.3 谷胱甘肽的主要生产方法 | 第19-21页 |
| 1.1.3.1 溶剂萃取法 | 第19页 |
| 1.1.3.2 化学合成法 | 第19页 |
| 1.1.3.3 发酵法 | 第19页 |
| 1.1.3.4 酶法 | 第19-21页 |
| 1.2 谷胱甘肽双功能合成酶GshF | 第21-24页 |
| 1.2.1 GshF的来源 | 第21页 |
| 1.2.2 GshF的结构和性质 | 第21-22页 |
| 1.2.3 GshF的研究背景 | 第22-24页 |
| 1.3 酶分子改造的策略 | 第24-27页 |
| 1.3.1 定向进化 | 第24-25页 |
| 1.3.2 理性设计 | 第25页 |
| 1.3.3 半理性设计 | 第25-27页 |
| 1.4 ATP再生系统 | 第27-29页 |
| 1.4.1 丙酮酸激酶PK | 第27页 |
| 1.4.2 多聚磷酸激酶PPK | 第27-29页 |
| 1.4.3 乙酸激酶ACK | 第29页 |
| 1.5 本课题的研究思路与内容 | 第29-32页 |
| 第二章 GshFSA的重组表达、纯化及酶学性质测定 | 第32-52页 |
| 2.1 引言 | 第32页 |
| 2.2 实验材料 | 第32-36页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第32-33页 |
| 2.2.2 主要耗材 | 第33页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第33-34页 |
| 2.2.4 培养基及试剂配制 | 第34-36页 |
| 2.2.4.1 培养基的配制 | 第34-35页 |
| 2.2.4.2 常用试剂的配制 | 第35-36页 |
| 2.3 实验方法 | 第36-42页 |
| 2.3.1 E. coli感受态细胞的制备 | 第36页 |
| 2.3.2 引物的设计和合成 | 第36-37页 |
| 2.3.3 重组表达载体的构建 | 第37-38页 |
| 2.3.4 表达菌株的构建与验证 | 第38-39页 |
| 2.3.5 GshFSA的表达与纯化 | 第39-40页 |
| 2.3.6 GshFSA的表达条件优化 | 第40页 |
| 2.3.7 GshFSA的酶活及酶学性质 | 第40-41页 |
| 2.3.8 谷胱甘肽GSH的DTNB法检测 | 第41-42页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第42-50页 |
| 2.4.1 重组质粒与重组菌的构建 | 第42-44页 |
| 2.4.2 GshFSA诱导表达条件的优化 | 第44-46页 |
| 2.4.2.1 诱导时机的优化 | 第44页 |
| 2.4.2.2 表达温度的优化 | 第44页 |
| 2.4.2.3 诱导剂浓度的优化 | 第44-46页 |
| 2.4.3 GshFSA的亲和纯化 | 第46-47页 |
| 2.4.4 GshFSA的酶学性质分析 | 第47-50页 |
| 2.4.4.1 温度对重组蛋白GshFSA酶活的影响 | 第47页 |
| 2.4.4.2 pH对重组蛋白GshFSA酶活的影响 | 第47-48页 |
| 2.4.4.3 ATP浓度对重组蛋白GshFSA酶活的影响 | 第48-49页 |
| 2.4.4.4 Mg~(2+)浓度对重组蛋白GshFSA酶活的影响 | 第49-50页 |
| 2.4.4.5 GshFSA的热稳定性 | 第50页 |
| 2.5 本章小结 | 第50-52页 |
| 第三章 定向进化提高GshFSA的酶活 | 第52-67页 |
| 3.1 引言 | 第52页 |
| 3.2 实验材料 | 第52-53页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第52-53页 |
| 3.2.2 主要耗材 | 第53页 |
| 3.2.3 主要仪器 | 第53页 |
| 3.2.4 培养基及试剂配制 | 第53页 |
| 3.3 实验方法 | 第53-58页 |
| 3.3.1 高通量筛选方法的建立 | 第53-56页 |
| 3.3.1.1 gshA缺陷型大肠杆菌的构建 | 第53-55页 |
| 3.3.1.2 GshFSA不同表达强度载体的构建 | 第55页 |
| 3.3.1.3 不同重组菌株对砷耐受性的影响 | 第55-56页 |
| 3.3.2 易错PCR及连接体系优化 | 第56-57页 |
| 3.3.3 突变体文库的构建及筛选 | 第57-58页 |
| 3.3.4 突变体GshFSA的酶学性质 | 第58页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第58-65页 |
| 3.4.1 高通量筛选方法的建立 | 第58-61页 |
| 3.4.1.1 gshA缺陷型大肠杆菌的构建 | 第58-60页 |
| 3.4.1.2 不同表达强度载体的构建 | 第60页 |
| 3.4.1.3 不同重组菌株对砷耐受性的关系 | 第60-61页 |
| 3.4.2 易错PCR及连接体系优化 | 第61-64页 |
| 3.4.2.1 易错PCR体系的优化 | 第61-63页 |
| 3.4.2.2 酶连接体系的优化 | 第63-64页 |
| 3.4.3 进化结果与突变体的酶活 | 第64页 |
| 3.4.4 突变体的酶学性质比较 | 第64-65页 |
| 3.5 本章小结 | 第65-67页 |
| 第四章 乙酸激酶的重组表达及用于再生ATP合成GSH | 第67-82页 |
| 4.1 引言 | 第67页 |
| 4.2 实验材料 | 第67-68页 |
| 4.2.1 质粒与菌株 | 第67页 |
| 4.2.2 主要耗材 | 第67页 |
| 4.2.3 主要仪器 | 第67页 |
| 4.2.4 培养基及试剂配制 | 第67-68页 |
| 4.3 实验方法 | 第68-72页 |
| 4.3.1 E.coli来源ack基因的扩增 | 第68页 |
| 4.3.2 ACK重组表达载体的构建 | 第68-69页 |
| 4.3.3 ACK的诱导表达与纯化 | 第69页 |
| 4.3.4 ACK活性和热稳定性分析 | 第69-71页 |
| 4.3.4.1 ATP、ADP、AMP和GSH的HPLC检测 | 第69-70页 |
| 4.3.4.2 ACK的酶活分析 | 第70页 |
| 4.3.4.3 ACK的热稳定性分析 | 第70-71页 |
| 4.3.5 再生底物乙酰磷酸盐的合成 | 第71页 |
| 4.3.6 ACK与GshFSA双酶偶联用于GSH的合成 | 第71-72页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第72-81页 |
| 4.4.1 E.coli来源ack基因的扩增 | 第72页 |
| 4.4.2 ACK重组表达载体的构建 | 第72-73页 |
| 4.4.3 ACK的诱导表达与纯化 | 第73-74页 |
| 4.4.4 ACK的活性及稳定性分析 | 第74-79页 |
| 4.4.4.1 ATP、ADP、AMP和GSH的标准曲线 | 第74-76页 |
| 4.4.4.2 ACK的催化效率 | 第76-77页 |
| 4.4.4.3 ACK催化的最适pH | 第77-79页 |
| 4.4.4.4 ACK催化的最适温度 | 第79页 |
| 4.4.4.5 ACK的热稳定性情况 | 第79页 |
| 4.4.5 ACK与GshFSA双酶偶联催化合成GSH | 第79-81页 |
| 4.5 本章小结 | 第81-82页 |
| 第五章 结论与展望 | 第82-84页 |
| 5.1 结论 | 第82-83页 |
| 5.2 展望 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-94页 |
| 附录 | 第94-97页 |
| 作者简介 | 第97页 |
