| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 英文缩略词表 | 第13-15页 |
| 1 前言 | 第15-32页 |
| 1.1 表观遗传修饰 | 第15-16页 |
| 1.2 组蛋白甲基化修饰 | 第16-18页 |
| 1.3 组蛋白乙酰化修饰 | 第18-25页 |
| 1.3.1 组蛋白乙酰转移酶 | 第18-19页 |
| 1.3.2 组蛋白去乙酰化酶 | 第19页 |
| 1.3.3 组蛋白乙酰化识别蛋白 | 第19-20页 |
| 1.3.4 BRD4 | 第20-25页 |
| 1.4 RNAm~6A修饰 | 第25-26页 |
| 1.5 RNAm~6A修饰酶 | 第26-30页 |
| 1.5.1 m~6A甲基转移酶 | 第27-28页 |
| 1.5.2 m~6A识别蛋白 | 第28页 |
| 1.5.3 m~6A去甲基化酶 | 第28-29页 |
| 1.5.4 ALKBH | 第29-30页 |
| 1.6 本文的研究目的和主要内容 | 第30-32页 |
| 2 BRD4小分子抑制剂筛选平台的建立 | 第32-46页 |
| 2.1 实验原理和材料 | 第32-35页 |
| 2.1.1 基于BLI分子间相互作用的BRD4活性测定原理 | 第32页 |
| 2.1.2 基于HTRF的BRD4活性测定原理 | 第32-33页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第33-34页 |
| 2.1.4 主要试剂 | 第34页 |
| 2.1.5 试剂配置 | 第34-35页 |
| 2.2 实验方法 | 第35-40页 |
| 2.2.1 pGEX-4T-1-BRD4(BD1)及pGEX-4T-1-BRD4(BD2)表达载体的构建及扩增 | 第35页 |
| 2.2.2 pGEX-4T-1-BRD4(BD1)和pGEX-4T-1-BRD4(BD2)重组蛋白的表达 | 第35-36页 |
| 2.2.3 蛋白的SDS-PAGE电泳检测 | 第36-37页 |
| 2.2.4 BCA法蛋白定量 | 第37页 |
| 2.2.5 基于BLI分子互作的重组pGEX-4T-1-BRD4(BD1)及pGEX-4T-1-BRD4(BD2)蛋白活性检测 | 第37-38页 |
| 2.2.6 基于HTRF的重组pGEX-4T-1-BRD4(BD1)及pGEX-4T-1-BRD4(BD2)蛋白活性检测 | 第38-39页 |
| 2.2.7 反应体系稳定性及实用性评价 | 第39页 |
| 2.2.8 吡唑类化合物对BRD4抑制活性评价 | 第39-40页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第40-45页 |
| 2.3.1 pGEX-4T-1-BRD4(BD1)及pGEX-4T-1-BRD4(BD2)原核表达载体的构建 | 第40页 |
| 2.3.2 pGEX-4T-1-BRD4(BD1)及pGEX-4T-1-BRD4(BD2)蛋白表达纯化结果. | 第40-41页 |
| 2.3.3 基于BLI分子相互作用的pGEX-4T-1-BRD4(BD1)及pGEX-4T-1-BRD4(BD2)重组蛋白活性测定结果 | 第41页 |
| 2.3.4 基于HTRF的BRD4(BD1)和BRD4(BD2)活性测定及条件优化结果 | 第41-43页 |
| 2.3.5 系统稳定性及应用性评价结果 | 第43-44页 |
| 2.3.6 吡唑类化合物对BRD4抑制活性评价结果 | 第44-45页 |
| 2.4 小结 | 第45-46页 |
| 3 新型吡唑类BRD4抑制剂WS-722的作用机制研究 | 第46-51页 |
| 3.1 实验材料 | 第46-47页 |
| 3.1.1 主要仪器设备 | 第46页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第46页 |
| 3.1.3 常用试剂配制 | 第46-47页 |
| 3.2 实验方法 | 第47-49页 |
| 3.2.1 可逆性实验 | 第47页 |
| 3.2.2 THP-1细胞培养 | 第47页 |
| 3.2.3 MTT实验 | 第47-48页 |
| 3.2.4 细胞总蛋白提取 | 第48页 |
| 3.2.5 Westenblotting | 第48页 |
| 3.2.6 细胞分化 | 第48-49页 |
| 3.3 实验结果 | 第49-50页 |
| 3.3.1 可逆性实验结果 | 第49页 |
| 3.3.2 WS-722细胞水平研究结果 | 第49页 |
| 3.3.3 WS-722对THP-1细胞分化影响研究结果 | 第49-50页 |
| 3.4 小结 | 第50-51页 |
| 4 ALKBH5小分子抑制剂筛选平台的建立 | 第51-64页 |
| 4.1 实验原理和材料 | 第51-53页 |
| 4.1.1 基于FDH酶联荧光反应的ALKBH5活性检测原理 | 第51页 |
| 4.1.2 基于AlphaScreen的ALKBH5活性检测原理 | 第51-52页 |
| 4.1.3 主要仪器设备 | 第52页 |
| 4.1.4 主要试剂 | 第52页 |
| 4.1.5 常用试剂配制 | 第52-53页 |
| 4.2 实验方法 | 第53-58页 |
| 4.2.1 pET-28b-FDH表达载体的构建及酶切验证 | 第53-54页 |
| 4.2.2 pMCSG19-ALKBH5表达载体的扩增 | 第54页 |
| 4.2.3 pET-28b-FDH重组蛋白的表达纯化 | 第54-55页 |
| 4.2.4 pMCSG19-ALKBH5重组蛋白的表达纯化 | 第55页 |
| 4.2.5 FDH的活性检测 | 第55-56页 |
| 4.2.6 ALKBH5活性的检测 | 第56-57页 |
| 4.2.7 基于AlphaScreen反应的ALKBH5小分子抑制剂筛选平台的优化和评价 | 第57-58页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第58-62页 |
| 4.3.1 pET28b-FDH及pMCSG19-ALKBH5载体的酶切验证 | 第58-59页 |
| 4.3.2 重组蛋白pET28b-FDH及pMCSG19-ALKBH5的表达纯化结果 | 第59-60页 |
| 4.3.3 重组蛋白pET28b-FDH活性测定结果 | 第60页 |
| 4.3.4 基于FDH酶联荧光反应的ALKBH5活性检测 | 第60-61页 |
| 4.3.5 基于AlphaScreen反应的ALKBH5活性检测及条件优化 | 第61页 |
| 4.3.6 筛选体系稳定性及柠檬酸盐对ALKBH5的抑制作用结果 | 第61-62页 |
| 4.4 小结 | 第62-64页 |
| 结论 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-79页 |
| 个人简历 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
