| 中文摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 第一章 绪论 | 第9-20页 |
| 1.1 尖孢镰刀菌胰蛋白酶的概述 | 第9-13页 |
| 1.1.1 胰蛋白酶的作用机理 | 第9-10页 |
| 1.1.2 胰蛋白酶的来源及应用 | 第10页 |
| 1.1.3 胰蛋白酶的生产 | 第10-11页 |
| 1.1.4 尖孢镰刀菌胰蛋白酶的产生及结构 | 第11-13页 |
| 1.1.5 尖孢镰刀菌胰蛋白酶的催化机理 | 第13页 |
| 1.2 胰蛋白酶的异源表达的研究概况 | 第13-17页 |
| 1.2.1 大肠杆菌表达系统及胰蛋白酶的生产 | 第13-15页 |
| 1.2.2 毕赤酵母表达系统及胰蛋白酶生产 | 第15-16页 |
| 1.2.3 胰蛋白酶异源表达的影响因素 | 第16-17页 |
| 1.3 尖孢镰刀菌胰蛋白酶工程 | 第17-18页 |
| 1.3.1 胰蛋白酶分子的改造策略 | 第17页 |
| 1.3.2 胰蛋白酶中N-端残留氨基酸的研究进展 | 第17-18页 |
| 1.4 本课题的立项依据、实验内容及意义 | 第18-20页 |
| 第二章 材料和方法 | 第20-30页 |
| 2.1 菌种与试剂 | 第20页 |
| 2.2 仪器及相关实验设备 | 第20-21页 |
| 2.3 培养基 | 第21页 |
| 2.3.1 LB培养基 | 第21页 |
| 2.3.2 YPD培养基 | 第21页 |
| 2.3.3 BMGY培养基 | 第21页 |
| 2.3.4 BMMY培养基 | 第21页 |
| 2.3.5 BSM分批发酵培养基 | 第21页 |
| 2.3.6 补料生长培养基 | 第21页 |
| 2.4 毕赤酵母重组质粒的构建 | 第21-25页 |
| 2.4.1 PCR扩增获得目的片段 | 第21-22页 |
| 2.4.2 质粒的提取及感受态细胞的制备 | 第22页 |
| 2.4.3 双酶切及其连接 | 第22-23页 |
| 2.4.4 转化 | 第23页 |
| 2.4.5 酶切验证及测序 | 第23-24页 |
| 2.4.6 毕赤酵母重组质粒的转化及重组子的验证 | 第24-25页 |
| 2.5 毕赤酵母重组菌以及尖孢镰刀菌的摇瓶发酵 | 第25页 |
| 2.5.1 活化培养 | 第25页 |
| 2.5.2 种子培养及P.pastoris重组菌诱导产酶 | 第25页 |
| 2.6 毕赤酵母重组菌的3L发酵罐发酵 | 第25-26页 |
| 2.7 胰蛋白酶酶活力测定 | 第26-27页 |
| 2.7.1 胰蛋白酶酰胺酶酶活的测定 | 第26-27页 |
| 2.8 胰蛋白酶的纯化 | 第27-28页 |
| 2.8.1 胰蛋白酶的纯化 | 第27页 |
| 2.8.2 胰蛋白酶的浓缩 | 第27页 |
| 2.8.3 SDS-PAGE电泳分析及蛋白浓度测定 | 第27-28页 |
| 2.9 胰蛋白酶酶学性质的测定 | 第28页 |
| 2.9.1 胰蛋白酶的最适pH及pH稳定性 | 第28页 |
| 2.9.2 胰蛋白酶的最适温度及温度稳定性 | 第28页 |
| 2.10 胰蛋白酶的酶反应动力学参数 | 第28-30页 |
| 第三章 结果与分析 | 第30-42页 |
| 3.1 P.pastoris重组质粒构建及验证 | 第30-31页 |
| 3.2 P.pastoris重组菌的构建及验证 | 第31-32页 |
| 3.3 P.pastoris重组菌的摇瓶发酵 | 第32-33页 |
| 3.4 P.pastoris重组菌3L罐高密度发酵 | 第33-34页 |
| 3.5 胰蛋白酶的分离纯化及SDS-PAGE分析 | 第34-35页 |
| 3.6 胰蛋白酶的最适pH及pH稳定性 | 第35-36页 |
| 3.7 胰蛋白酶的最适温度及温度稳定性 | 第36-38页 |
| 3.8 胰蛋白酶的酶反应动力学参数 | 第38-39页 |
| 3.9 野生型与重组的胰蛋白酶分子模拟及分析 | 第39-42页 |
| 第四章 讨论和结论 | 第42-44页 |
| 4.1 讨论 | 第42-43页 |
| 4.2 结论 | 第43-44页 |
| 补充部分NahE蛋白结构解析 | 第44-53页 |
| 第一章 前言 | 第44-45页 |
| 第二章 材料和方法 | 第45-49页 |
| 2.1 蛋白质表达载体的构建 | 第45页 |
| 2.2 蛋白的表达和纯化 | 第45-47页 |
| 2.2.1 蛋白的可溶性检测 | 第45-46页 |
| 2.2.2 蛋白的纯化 | 第46页 |
| 2.2.3 蛋白的浓缩 | 第46页 |
| 2.2.4 硒代甲硫氨酸蛋白衍生物的制备 | 第46-47页 |
| 2.3 蛋白晶体的初筛与优化 | 第47-49页 |
| 2.3.1 材料和方法 | 第47页 |
| 2.3.2 晶体的初筛和优化方法 | 第47-49页 |
| 第三章 结果和讨论 | 第49-53页 |
| 3.1 NahE和Se-Met蛋白的分离纯化及SDS-PAGE分析 | 第49页 |
| 3.3 晶体的筛选与优化 | 第49-51页 |
| 3.4 衍射数据的收集 | 第51-52页 |
| 3.5 本章小结 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-58页 |
| 在学期间的研究成果 | 第58-59页 |
| 致谢 | 第59页 |
