| 缩略词表 | 第7-8页 |
| 氨基酸缩略词表 | 第8-9页 |
| 中文摘要 | 第9-10页 |
| ABSTRACT | 第10页 |
| 第一部分 文献综述 | 第11-25页 |
| 1. 聚酮化合物简介 | 第11页 |
| 2. 聚酮的生物合成 | 第11-15页 |
| 2.1 聚酮的核心结构的合成 | 第12-15页 |
| 2.2 核心结构的后修饰反应 | 第15页 |
| 3. 非天然聚酮化合物的前体定向生物合成 | 第15-16页 |
| 4. 杰多霉素综述 | 第16-24页 |
| 4.1 杰多霉素简介 | 第16-17页 |
| 4.2 链霉菌简介 | 第17-18页 |
| 4.3 杰多霉素的生物合成途径 | 第18-19页 |
| 4.4 杰多霉素的合成基因簇 | 第19-24页 |
| 4.4.1 参与聚酮长链合成的基因(jadABCJMN) | 第19-21页 |
| 4.4.2 参与杰多霉素核心结构合成的基因(jadDEI) | 第21-22页 |
| 4.4.3 杰多霉素后修饰氧化酶基因(jadFGH) | 第22-23页 |
| 4.4.4 参与糖基合成与转移的基因(jadXOPSQTUV) | 第23-24页 |
| 5. 论文的主要内容和意义 | 第24-25页 |
| 第二部分 杰多霉素的前体定向生物合成、分离纯化及活性研究 | 第25-43页 |
| 1. 前言 | 第25页 |
| 2. 实验材料 | 第25-27页 |
| 2.1 菌株和细胞 | 第25页 |
| 2.2 培养基 | 第25-26页 |
| 2.3 缓冲液 | 第26页 |
| 2.4 主要试剂 | 第26-27页 |
| 3. 实验方法 | 第27-29页 |
| 3.1 委内瑞拉链霉菌培养条件(Doull et al.,1994) | 第27页 |
| 3.2 发酵液预处理 | 第27页 |
| 3.3 高效液相色谱(HPLC)检测 | 第27页 |
| 3.4 质谱(MS)分析 | 第27页 |
| 3.5 杰多霉素的分离纯化 | 第27-28页 |
| 3.6 细胞培养 | 第28页 |
| 3.7 杰多霉素的Aurora A/B激酶活性抑制试验 | 第28-29页 |
| 3.8 杰多霉素的细胞增殖抑制试验 | 第29页 |
| 4. 结果与分析 | 第29-41页 |
| 4.1 杰多霉素化合物的生物合成与检测 | 第29-32页 |
| 4.2 杰多霉素的分离纯化 | 第32-38页 |
| 4.2.1 杰多霉素B的分离纯化及定量 | 第33-34页 |
| 4.2.2 杰多霉素V的分离纯化 | 第34页 |
| 4.2.3 杰多霉素L的分离纯化 | 第34-35页 |
| 4.2.4 杰多霉素Daba的分离纯化 | 第35页 |
| 4.2.5 同型丝氨酸衍生的杰多霉素Hse的纯化 | 第35-36页 |
| 4.2.6 2-氨基丁酸衍生的杰多霉素Abu的纯化 | 第36页 |
| 4.2.7 丙氨酸衍生的杰多霉素Ala的纯化 | 第36-37页 |
| 4.2.8 正亮氨酸衍生的杰多霉素Nle的纯化 | 第37页 |
| 4.2.9 丝氨酸衍生的杰多霉素Ser纯化 | 第37-38页 |
| 4.3 杰多霉素衍生物的生物活性检测 | 第38-41页 |
| 4.3.1 杰多霉素衍生物的Aurora A/B激酶抑制活性评价 | 第38-39页 |
| 4.3.2 杰多霉素衍生物的细胞增殖抑制活性评价 | 第39-41页 |
| 5. 讨论 | 第41-43页 |
| 第三部分 杰多霉素后修饰酶JADH关键氨基酸的确定 | 第43-62页 |
| 1. 前言 | 第43页 |
| 2. 实验材料 | 第43-46页 |
| 2.1 菌种与质粒 | 第43-44页 |
| 2.2 培养基、缓冲液及电泳胶 | 第44-46页 |
| 3. 实验方法 | 第46-50页 |
| 3.1 E.coli BL21感受态的制备(Sambrook et al.,2001) | 第46页 |
| 3.2 碱裂法提取大肠杆菌质粒(Sambrook et al.,2001) | 第46-47页 |
| 3.3 PCR产物鉴定-琼脂糖凝胶电泳 | 第47页 |
| 3.4 使用Gel extraction kit(OMIGA)回收目的DNA片段 | 第47页 |
| 3.5 感受态细胞E.coli BL21的转化 | 第47页 |
| 3.6 菌种保存 | 第47-48页 |
| 3.7 DNA测序 | 第48页 |
| 3.8 菌体的培养与JadH的诱导表达 | 第48页 |
| 3.9 JadH粗酶液的获得 | 第48页 |
| 3.10 蛋白的SDS-PAGE检测 | 第48页 |
| 3.11 Ni亲和柱层析 | 第48-49页 |
| 3.12 蛋白浓缩 | 第49页 |
| 3.13 Bradford法测定蛋白浓度 | 第49页 |
| 3.14 JadH酶的体外催化实验 | 第49页 |
| 3.15 底物CR2和dhR的HPLC检测 | 第49-50页 |
| 4. 结果与分析 | 第50-60页 |
| 4.1 JadH的结构模型构建和分析 | 第50-52页 |
| 4.2 表达载体pET30a-jadH-nHis的构建 | 第52-53页 |
| 4.3 pET30a-jadH-nHis PCR定点突变 | 第53-56页 |
| 4.3.1 设计突变引物 | 第53-54页 |
| 4.3.2 PCR定点突变 | 第54-56页 |
| 4.4 JadH蛋白表达、纯化与活性鉴定 | 第56-60页 |
| 4.4.1 菌体的培养与JadH的诱导表达 | 第56-57页 |
| 4.4.2 Ni亲和柱对JadH野生型和突变型蛋白进行纯化 | 第57-58页 |
| 4.4.3 纯化得到的JadH蛋白浓度的定量 | 第58页 |
| 4.4.4 JadH体外酶催化实验及HPLC监测 | 第58-60页 |
| 5. 讨论 | 第60-62页 |
| 第四部分 总结 | 第62-64页 |
| 参考文献 | 第64-68页 |
| 攻读硕士学位期间已发表的研究成果 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 附录 杰多霉素衍生物质谱图 | 第70-71页 |
