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杰多霉素衍生物的生物合成及生物活性研究

缩略词表第7-8页
氨基酸缩略词表第8-9页
中文摘要第9-10页
ABSTRACT第10页
第一部分 文献综述第11-25页
    1. 聚酮化合物简介第11页
    2. 聚酮的生物合成第11-15页
        2.1 聚酮的核心结构的合成第12-15页
        2.2 核心结构的后修饰反应第15页
    3. 非天然聚酮化合物的前体定向生物合成第15-16页
    4. 杰多霉素综述第16-24页
        4.1 杰多霉素简介第16-17页
        4.2 链霉菌简介第17-18页
        4.3 杰多霉素的生物合成途径第18-19页
        4.4 杰多霉素的合成基因簇第19-24页
            4.4.1 参与聚酮长链合成的基因(jadABCJMN)第19-21页
            4.4.2 参与杰多霉素核心结构合成的基因(jadDEI)第21-22页
            4.4.3 杰多霉素后修饰氧化酶基因(jadFGH)第22-23页
            4.4.4 参与糖基合成与转移的基因(jadXOPSQTUV)第23-24页
    5. 论文的主要内容和意义第24-25页
第二部分 杰多霉素的前体定向生物合成、分离纯化及活性研究第25-43页
    1. 前言第25页
    2. 实验材料第25-27页
        2.1 菌株和细胞第25页
        2.2 培养基第25-26页
        2.3 缓冲液第26页
        2.4 主要试剂第26-27页
    3. 实验方法第27-29页
        3.1 委内瑞拉链霉菌培养条件(Doull et al.,1994)第27页
        3.2 发酵液预处理第27页
        3.3 高效液相色谱(HPLC)检测第27页
        3.4 质谱(MS)分析第27页
        3.5 杰多霉素的分离纯化第27-28页
        3.6 细胞培养第28页
        3.7 杰多霉素的Aurora A/B激酶活性抑制试验第28-29页
        3.8 杰多霉素的细胞增殖抑制试验第29页
    4. 结果与分析第29-41页
        4.1 杰多霉素化合物的生物合成与检测第29-32页
        4.2 杰多霉素的分离纯化第32-38页
            4.2.1 杰多霉素B的分离纯化及定量第33-34页
            4.2.2 杰多霉素V的分离纯化第34页
            4.2.3 杰多霉素L的分离纯化第34-35页
            4.2.4 杰多霉素Daba的分离纯化第35页
            4.2.5 同型丝氨酸衍生的杰多霉素Hse的纯化第35-36页
            4.2.6 2-氨基丁酸衍生的杰多霉素Abu的纯化第36页
            4.2.7 丙氨酸衍生的杰多霉素Ala的纯化第36-37页
            4.2.8 正亮氨酸衍生的杰多霉素Nle的纯化第37页
            4.2.9 丝氨酸衍生的杰多霉素Ser纯化第37-38页
        4.3 杰多霉素衍生物的生物活性检测第38-41页
            4.3.1 杰多霉素衍生物的Aurora A/B激酶抑制活性评价第38-39页
            4.3.2 杰多霉素衍生物的细胞增殖抑制活性评价第39-41页
    5. 讨论第41-43页
第三部分 杰多霉素后修饰酶JADH关键氨基酸的确定第43-62页
    1. 前言第43页
    2. 实验材料第43-46页
        2.1 菌种与质粒第43-44页
        2.2 培养基、缓冲液及电泳胶第44-46页
    3. 实验方法第46-50页
        3.1 E.coli BL21感受态的制备(Sambrook et al.,2001)第46页
        3.2 碱裂法提取大肠杆菌质粒(Sambrook et al.,2001)第46-47页
        3.3 PCR产物鉴定-琼脂糖凝胶电泳第47页
        3.4 使用Gel extraction kit(OMIGA)回收目的DNA片段第47页
        3.5 感受态细胞E.coli BL21的转化第47页
        3.6 菌种保存第47-48页
        3.7 DNA测序第48页
        3.8 菌体的培养与JadH的诱导表达第48页
        3.9 JadH粗酶液的获得第48页
        3.10 蛋白的SDS-PAGE检测第48页
        3.11 Ni亲和柱层析第48-49页
        3.12 蛋白浓缩第49页
        3.13 Bradford法测定蛋白浓度第49页
        3.14 JadH酶的体外催化实验第49页
        3.15 底物CR2和dhR的HPLC检测第49-50页
    4. 结果与分析第50-60页
        4.1 JadH的结构模型构建和分析第50-52页
        4.2 表达载体pET30a-jadH-nHis的构建第52-53页
        4.3 pET30a-jadH-nHis PCR定点突变第53-56页
            4.3.1 设计突变引物第53-54页
            4.3.2 PCR定点突变第54-56页
        4.4 JadH蛋白表达、纯化与活性鉴定第56-60页
            4.4.1 菌体的培养与JadH的诱导表达第56-57页
            4.4.2 Ni亲和柱对JadH野生型和突变型蛋白进行纯化第57-58页
            4.4.3 纯化得到的JadH蛋白浓度的定量第58页
            4.4.4 JadH体外酶催化实验及HPLC监测第58-60页
    5. 讨论第60-62页
第四部分 总结第62-64页
参考文献第64-68页
攻读硕士学位期间已发表的研究成果第68-69页
致谢第69-70页
附录 杰多霉素衍生物质谱图第70-71页

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