| 摘要 | 第10-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 缩略词表(Abbreviation) | 第13-14页 |
| 第一部分 文献综述 | 第14-29页 |
| 1 口蹄疫研究进展 | 第14-20页 |
| 1.1 口蹄疫及其危害 | 第14页 |
| 1.2 口蹄疫病原 | 第14-15页 |
| 1.3 口蹄疫的流行病学 | 第15-16页 |
| 1.4 口蹄疫诊断技术 | 第16-20页 |
| 1.4.1 病毒分离 | 第16页 |
| 1.4.2 血清学诊断技术 | 第16-19页 |
| 1.4.3 分子生物学检测技术 | 第19-20页 |
| 1.5 口蹄疫防制 | 第20页 |
| 2 免疫胶体金技术及其研究进展 | 第20-29页 |
| 2.1 胶体金技术的基本原理 | 第21页 |
| 2.2 胶体金的制备及胶体金的标记 | 第21-23页 |
| 2.2.1 胶体金的制备 | 第21-22页 |
| 2.2.2 胶体金的标记 | 第22页 |
| 2.2.3 胶体金标记后的纯化 | 第22-23页 |
| 2.3 免疫胶体金技术的应用 | 第23-26页 |
| 2.3.1 免疫胶体金技术在电镜上的应用 | 第23页 |
| 2.3.2 免疫胶体金技术在生物传感器上的应用 | 第23页 |
| 2.3.3 免疫胶体金快速诊断技术 | 第23-26页 |
| 2.4 免疫胶体金检测技术的优点 | 第26页 |
| 2.5 前景与展望 | 第26-29页 |
| 2.5.1 进一步提高检测的灵敏度 | 第27页 |
| 2.5.2 实现多元检测 | 第27页 |
| 2.5.3 实现半定量或定量检测 | 第27-29页 |
| 第二部分 试验与研究 | 第29-66页 |
| 第一章 口蹄疫3AB基因的克隆、蛋白表达与纯化 | 第29-45页 |
| 1 材料 | 第29-31页 |
| 1.1 细菌菌株及质粒载体 | 第29页 |
| 1.2 主要试剂 | 第29页 |
| 1.3 主要仪器 | 第29-30页 |
| 1.4 主要试剂溶液的配制 | 第30-31页 |
| 1.4.1 细菌培养相关溶液 | 第30页 |
| 1.4.2 SDS-PAGE相关溶液配制 | 第30页 |
| 1.4.3 蛋白纯化相关溶液 | 第30-31页 |
| 2 方法 | 第31-37页 |
| 2.1 FMD非结构蛋白3AB基因的获得 | 第31-32页 |
| 2.2 表达载体的构建与转化 | 第32-34页 |
| 2.2.1 质粒pET-28a(+)的提取 | 第32页 |
| 2.2.2 PCR产物的纯化与回收 | 第32页 |
| 2.2.3 目的片段DNA与质粒载体的酶切回收 | 第32-33页 |
| 2.2.4 3AB基因与质粒载体PET-28a(+)的连接 | 第33页 |
| 2.2.5 E.Coli超级感受态的制备 | 第33页 |
| 2.2.6 重组质粒的转化 | 第33-34页 |
| 2.3 重组子的筛选、鉴定和序列分析 | 第34-35页 |
| 2.3.1 PCR反应模板的制备 | 第34页 |
| 2.3.2 特异性引物PCR筛选 | 第34页 |
| 2.3.3 重组质粒pET-28-3AB的提取及酶切鉴定 | 第34-35页 |
| 2.3.4 序列分析 | 第35页 |
| 2.4 3AB基因在大肠杆菌中的表达 | 第35-36页 |
| 2.4.1 筛选高表达菌株 | 第35页 |
| 2.4.2 高表达条件的优化 | 第35-36页 |
| 2.5 表达蛋白的纯化与复性 | 第36-37页 |
| 2.5.1 高表达菌株的大量表达 | 第36页 |
| 2.5.2 表达菌体的收集和破碎 | 第36页 |
| 2.5.3 包涵体的处理 | 第36-37页 |
| 2.5.4 表达蛋白的纯化与复性 | 第37页 |
| 2.5.5 Ni柱纯化过程中Elution Buffer最佳咪唑浓度的确定 | 第37页 |
| 2.5.6 3AB蛋白纯化产物分析以及浓度测定 | 第37页 |
| 3 结果与分析 | 第37-44页 |
| 3.1 3AB基因的扩增 | 第38页 |
| 3.2 表达载体的构建、重组子的筛选、鉴定以及序列分析比对 | 第38-40页 |
| 3.2.1 表达载体的构建 | 第38页 |
| 3.2.2 3AB与质粒连接转化后的阳性克隆筛选 | 第38-39页 |
| 3.2.3 3AB重组子阳性克隆的酶切鉴定 | 第39页 |
| 3.2.4 3AB重组子的序列分析比对 | 第39-40页 |
| 3.3 3AB基因在大肠杆菌中的表达 | 第40-42页 |
| 3.3.1 筛选高表达菌株 | 第40-41页 |
| 3.3.2 最适IPTG浓度的确定 | 第41页 |
| 3.3.3 最适诱导时间的确定 | 第41-42页 |
| 3.4 3AB蛋白的纯化与复性 | 第42-44页 |
| 3.4.1 Ni柱纯化过程中Elution Buffer最佳咪唑浓度的确定 | 第42-43页 |
| 3.4.2 3AB蛋白纯化产物分析以及浓度测定 | 第43-44页 |
| 4 讨论 | 第44-45页 |
| 第二章 猪口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体间接ELISA检测方法的建立 | 第45-54页 |
| 1 材料和方法 | 第45-47页 |
| 1.1 材料 | 第45页 |
| 1.1.1 试剂及仪器 | 第45页 |
| 1.1.2 抗原口蹄疫重组3AB非结构蛋白由笔者构建并纯化 | 第45页 |
| 1.1.3 血清 | 第45页 |
| 1.2 方法 | 第45-47页 |
| 1.2.1 表达蛋白间接ELISA检测方法的建立 | 第45-47页 |
| 1.2.2 特异性试验 | 第47页 |
| 1.2.3 重复性试验 | 第47页 |
| 1.2.4 干燥方法及稳定性试验 | 第47页 |
| 1.2.5 符合率检验 | 第47页 |
| 2 结果与分析 | 第47-52页 |
| 2.1 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释倍数的选择 | 第47-48页 |
| 2.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定结果 | 第48页 |
| 2.3 最佳封闭液和稀释液的确定结果 | 第48-49页 |
| 2.4 血清、二抗最佳作用时间的选择结果 | 第49-50页 |
| 2.5 底物最佳显色时间的确定 | 第50页 |
| 2.6 判定标准的确定 | 第50页 |
| 2.7 特异性试验结果 | 第50页 |
| 2.8 重复性试验结果 | 第50-51页 |
| 2.9 干燥方法及稳定性试验结果 | 第51页 |
| 2.10 符合率检验结果 | 第51-52页 |
| 3 分析与讨论 | 第52-54页 |
| 第三章 应用免疫胶体金技术快速检测口蹄疫非结构蛋白3AB抗体的研究 | 第54-66页 |
| 1 材料 | 第54-55页 |
| 1.1 主要试剂及仪器 | 第54页 |
| 1.2 抗原 | 第54页 |
| 1.3 对照血清 | 第54页 |
| 1.4 待检血清 | 第54页 |
| 1.5 主要试剂溶液的配置 | 第54-55页 |
| 2 方法 | 第55-58页 |
| 2.1 胶体金的制备 | 第55页 |
| 2.1.1 玻璃器皿的清洗 | 第55页 |
| 2.1.2 胶体金颗粒的烧制 | 第55页 |
| 2.2 SPA胶体金的制备 | 第55-56页 |
| 2.2.1 SPA最佳标记量的确定 | 第55-56页 |
| 2.2.2 胶体金标记及纯化 | 第56页 |
| 2.3 斑点免疫金渗滤法(DIGFA) | 第56-57页 |
| 2.3.1 反应盒的组装 | 第56-57页 |
| 2.3.3 DIGFA最佳点样抗原浓度的选择 | 第57页 |
| 2.3.4 封闭液的选择 | 第57页 |
| 2.3.5 胶体金标记SPA最佳浓度的选择 | 第57页 |
| 2.4 胶体金免疫层析试纸法(GICA) | 第57-58页 |
| 2.4.1 金标垫的制备 | 第57页 |
| 2.4.2 T线及C线的包被 | 第57页 |
| 2.4.3 试纸条的组装 | 第57-58页 |
| 2.4.4 免疫层析试纸法操作步骤 | 第58页 |
| 2.4.5 T线及C线最佳包被浓度优化 | 第58页 |
| 2.4.6 金标SPA最佳工作浓度的选择 | 第58页 |
| 3 结果 | 第58-64页 |
| 3.1 SPA最佳标记量的确定 | 第58页 |
| 3.2 DIGFA法试验结果 | 第58-62页 |
| 3.2.1 DIGFA法最适条件的选择 | 第58-60页 |
| 3.2.2 特异性试验 | 第60页 |
| 3.2.3 DIGFA法与ELISA方法检测结果比较 | 第60-61页 |
| 3.2.4 DIGFA法重复性试验 | 第61页 |
| 3.2.5 稳定性试验 | 第61-62页 |
| 3.3 GICA法试验结果 | 第62-64页 |
| 3.3.1 GICA法最适条件的优化 | 第62-63页 |
| 3.3.2 特异性试验 | 第63页 |
| 3.3.3 临床试验 | 第63-64页 |
| 4 讨论 | 第64-66页 |
| 全文总结 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-74页 |
| 在学期间论文发表情况 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
