| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第15-17页 |
| 第1章 文献综述 | 第17-30页 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征 | 第17页 |
| 1.2 PRRS的流行病学特点 | 第17-18页 |
| 1.3 PRRSV的病原特性 | 第18-19页 |
| 1.3.1 病毒的分类及特性 | 第18页 |
| 1.3.2 PRRSV的生物学特性 | 第18-19页 |
| 1.4 PRRSV分子生物学 | 第19-24页 |
| 1.4.1 基因组的基本结构 | 第19-20页 |
| 1.4.2 PRRSV的蛋白质 | 第20-23页 |
| 1.4.3 PRRSV的遗传变异 | 第23-24页 |
| 1.5 PRRS的诊断研究 | 第24-26页 |
| 1.5.1 病毒分离 | 第25页 |
| 1.5.2 分子生物学检测方法 | 第25页 |
| 1.5.3 血清学诊断方法 | 第25-26页 |
| 1.6 PRRSV的免疫学反应 | 第26-28页 |
| 1.6.1 体液免疫反应 | 第26-27页 |
| 1.6.2 细胞免疫反应 | 第27-28页 |
| 1.7 PRRS疫苗研究进展 | 第28-30页 |
| 1.7.1 PRRS传统常规疫苗 | 第28页 |
| 1.7.2 PRRS新型疫苗研究进展 | 第28-30页 |
| 第2章 高致病性PRRSV双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制 | 第30-74页 |
| 2.1 材料 | 第30-35页 |
| 2.1.1 毒株、细胞与菌株 | 第30-31页 |
| 2.1.2 载体和质粒 | 第31-32页 |
| 2.1.3 抗体、酶和相关试剂 | 第32页 |
| 2.1.4 培养基与抗生素及其配制 | 第32-33页 |
| 2.1.5 主要缓冲液与相关试剂及其配制 | 第33-35页 |
| 2.1.6 实验动物 | 第35页 |
| 2.2 方法 | 第35-49页 |
| 2.2.1 细胞培养和病毒增殖 | 第35页 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取 | 第35-36页 |
| 2.2.3 cDNA的合成 | 第36页 |
| 2.2.4 ORF7基因的扩增 | 第36-37页 |
| 2.2.5 限制性内切酶酶切反应 | 第37页 |
| 2.2.6 PCR产物或酶切产物的电泳检测 | 第37页 |
| 2.2.7 PCR产物或酶切产物的回收与纯化 | 第37-38页 |
| 2.2.8 外源DNA片段与质粒载体的连接反应 | 第38页 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第38-39页 |
| 2.2.10 连接产物的转化 | 第39页 |
| 2.2.11 质粒的小量制备 | 第39-40页 |
| 2.2.12 诱导表达 | 第40页 |
| 2.2.13 SDS-PAGE电泳 | 第40页 |
| 2.2.14 Western blot检测分析 | 第40-41页 |
| 2.2.15 免疫原的制备 | 第41页 |
| 2.2.16 免疫程序 | 第41页 |
| 2.2.17 SP2/0骨髓瘤细胞的活化 | 第41-42页 |
| 2.2.18 SP2/0骨髓瘤细胞的制备 | 第42页 |
| 2.2.19 免疫脾细胞的制备 | 第42页 |
| 2.2.20 饲养细胞的制备 | 第42-43页 |
| 2.2.21 细胞融合 | 第43页 |
| 2.2.22 阳性杂交瘤细胞的筛选 | 第43-44页 |
| 2.2.23 杂交瘤细胞的克隆化 | 第44页 |
| 2.2.24 单克隆抗体的生产 | 第44页 |
| 2.2.25 单克隆抗体特性的鉴定 | 第44-45页 |
| 2.2.26 单克隆抗体的纯化 | 第45页 |
| 2.2.27 标准阴、阳性对照的制备 | 第45页 |
| 2.2.28 双抗体夹心ELISA检测方法条件的优化 | 第45-46页 |
| 2.2.29 单抗包被板的制备 | 第46页 |
| 2.2.30 单抗与PRRSV经典毒株和变异毒株反应性的研究 | 第46-47页 |
| 2.2.31 特异性检验 | 第47页 |
| 2.2.32 敏感性检验 | 第47页 |
| 2.2.33 重复性检验 | 第47页 |
| 2.2.34 符合率检验 | 第47页 |
| 2.2.35 试剂盒的稳定性检测 | 第47-48页 |
| 2.2.36 人工接种动物的抗原消长规律的研究 | 第48-49页 |
| 2.3 结果与分析 | 第49-70页 |
| 2.3.1 PRRSV ORF7基因的RT-PCR结果 | 第49-50页 |
| 2.3.2 原核表达质粒的构建 | 第50页 |
| 2.3.3 重组N蛋白的原核表达 | 第50-51页 |
| 2.3.4 Western Blotting检测 | 第51-52页 |
| 2.3.5 免疫原的制备 | 第52页 |
| 2.3.6 细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选 | 第52-53页 |
| 2.3.7 单抗腹水的制备 | 第53页 |
| 2.3.8 单抗效价的测定 | 第53页 |
| 2.3.9 单抗与PRRSV的反应性研究 | 第53-54页 |
| 2.3.10 单抗亚类的鉴定 | 第54页 |
| 2.3.11 单抗的纯化 | 第54页 |
| 2.3.12 包被抗体和酶标记物的选择 | 第54-55页 |
| 2.3.13 方阵滴定确定包被抗体和酶标记物的浓度 | 第55-56页 |
| 2.3.14 抗原和包被单抗最佳反应时间的确定 | 第56页 |
| 2.3.15 酶标记物与抗原最佳反应时间的确定 | 第56-57页 |
| 2.3.16 底物液最佳反应时间的确定 | 第57页 |
| 2.3.17 临界值的确定 | 第57-60页 |
| 2.3.18 ELISA操作程序的确定 | 第60-61页 |
| 2.3.19 经典毒株和变异毒株的检测 | 第61-62页 |
| 2.3.20 特异性检测 | 第62-63页 |
| 2.3.21 敏感性检测 | 第63-64页 |
| 2.3.22 重复性检测 | 第64-66页 |
| 2.3.23 符合率检测 | 第66-68页 |
| 2.3.24 稳定性检测 | 第68-69页 |
| 2.3.25 人工感染动物的抗原消长规律的研究 | 第69-70页 |
| 2.4 讨论 | 第70-73页 |
| 2.4.1 ORF7基因的原核表达 | 第70-71页 |
| 2.4.2 抗PRRSV N蛋白单克隆抗体的制备 | 第71页 |
| 2.4.3 双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制 | 第71-73页 |
| 2.5 小结 | 第73-74页 |
| 第3章 伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒(rPRV-PRRSV)重组基因工程疫苗的研究 | 第74-115页 |
| 3.1 材料 | 第75-84页 |
| 3.1.1 毒株、细胞与菌株 | 第75页 |
| 3.1.2 载体和质粒 | 第75-78页 |
| 3.1.3 抗体、酶和相关试剂 | 第78-79页 |
| 3.1.4 培养基与抗生素及其配制 | 第79-80页 |
| 3.1.5 免疫反应试验所用抗原及血清 | 第80页 |
| 3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制 | 第80-84页 |
| 3.1.7 实验动物 | 第84页 |
| 3.2 方法 | 第84-98页 |
| 3.2.1 细胞培养和病毒增殖 | 第84页 |
| 3.2.2 感染病毒的细胞样品总RNA的提取 | 第84-85页 |
| 3.2.3 总cDNA的合成及各个基因的PCR扩增 | 第85页 |
| 3.2.4 限制性内切酶酶切反应 | 第85页 |
| 3.2.5 PCR产物或酶切产物的电泳检测 | 第85-86页 |
| 3.2.6 线性质粒DNA末端去磷酸化 | 第86页 |
| 3.2.7 PCR产物或酶切产物的回收与纯化 | 第86页 |
| 3.2.8 外源DNA片段与质粒载体的连接反应 | 第86-87页 |
| 3.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第87页 |
| 3.2.10 连接产物的转化 | 第87页 |
| 3.2.11 质粒的制备与鉴定 | 第87-88页 |
| 3.2.12 重组伪狂犬病毒(PRV)基因组DNA的提取 | 第88-89页 |
| 3.2.13 脂质体共转染法 | 第89-90页 |
| 3.2.14 重组病毒的空斑纯化 | 第90-91页 |
| 3.2.15 PCR检测目的外源基因在重组病毒中的整合 | 第91页 |
| 3.2.16 Southern blot印迹分析 | 第91-92页 |
| 3.2.17 Western blot检测目的蛋白在真核细胞中的表达 | 第92-93页 |
| 3.2.18 GP5-ELISA试验 | 第93页 |
| 3.2.19 半数细胞培养物感染量(TCID50)的测定 | 第93页 |
| 3.2.20 微量中和试验(固定病毒-稀释血清法) | 第93-94页 |
| 3.2.21 构建重组杆状病毒的操作流程及示意图 | 第94页 |
| 3.2.22 重组穿梭载体(Bacmid)的构建 | 第94-95页 |
| 3.2.23 重组穿梭载体(Bacmid)的提取 | 第95页 |
| 3.2.24 重组杆状病毒获得及毒价测定 | 第95页 |
| 3.2.25 重组杆状病毒转导哺乳动物细胞 | 第95页 |
| 3.2.26 小鼠脾淋巴细胞的制备 | 第95-96页 |
| 3.2.27 样品总RNA的提取及cDNA的合成 | 第96页 |
| 3.2.28 SYBR Green Ⅰ实时定量PCR | 第96-97页 |
| 3.2.29 相对mRNA表达水平的计算 | 第97页 |
| 3.2.30 IFN-γ的定量检测(双抗体夹心ELISA) | 第97页 |
| 3.2.31 动物实验 | 第97-98页 |
| 3.2.32 统计学方法 | 第98页 |
| 3.3 结果与分析 | 第98-112页 |
| 3.3.1 转移质粒pgG-CMV-EGFP的构建 | 第98-99页 |
| 3.3.2 转移质粒pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut的构建 | 第99-100页 |
| 3.3.3 转移质粒pgG-CMV-ORF545-2m的构建 | 第100-103页 |
| 3.3.4 重组病毒的构建与纯化 | 第103-106页 |
| 3.3.5 重组病毒的Southern杂交鉴定 | 第106-107页 |
| 3.3.6 重组病毒的Western blot鉴定 | 第107-108页 |
| 3.3.7 免疫小鼠抗PRV特异性抗体的检测 | 第108-109页 |
| 3.3.8 免疫小鼠特异性针对PRRSV GP5的ELISA抗体 | 第109-110页 |
| 3.3.9 免疫小鼠特异性针对PRRSV的中和抗体 | 第110页 |
| 3.3.10 ELISA方法分析免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ水平 | 第110-111页 |
| 3.3.11 实时荧光定量PCR检测小鼠脾细胞中IFN-γ mRNA表达 | 第111-112页 |
| 3.4 讨论 | 第112-114页 |
| 3.5 小结 | 第114-115页 |
| 第4章 杆状病毒表达系统介导的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗研究 | 第115-125页 |
| 4.1 材料 | 第115页 |
| 4.2 方法 | 第115页 |
| 4.3 结果与分析 | 第115-122页 |
| 4.3.1 转移质粒pFastBac-CMV-3456的构建 | 第115-117页 |
| 4.3.2 重组Bacmid-CMV-3456的构建 | 第117页 |
| 4.3.3 重组杆状病毒BV-CMV-3456的获得 | 第117页 |
| 4.3.4 外源基因在哺乳动物细胞内的转录与表达 | 第117-118页 |
| 4.3.5 重组病毒的纯化与毒价测定 | 第118-119页 |
| 4.3.6 免疫小鼠的ELISA抗体水平 | 第119-120页 |
| 4.3.7 免疫小鼠的中和抗体水平检测 | 第120页 |
| 4.3.8 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γ mRNA表达 | 第120-122页 |
| 4.3.9 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平分析 | 第122页 |
| 4.4 讨论 | 第122-124页 |
| 4.5 小结 | 第124-125页 |
| 参考文献 | 第125-143页 |
| 致谢 | 第143-144页 |
| 附录 | 第144页 |
