| 中文摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-12页 |
| 第一部分 文献综述 | 第12-22页 |
| 1 抵抗素基因及分子结构 | 第12页 |
| 2 抵抗素的分布表达和影响因素 | 第12-13页 |
| 3 抵抗素的作用机制 | 第13-14页 |
| ·肝脏内胰岛素抵抗 | 第13页 |
| ·脂肪组织内胰岛素抵抗 | 第13-14页 |
| ·骨骼肌中胰岛素抵抗 | 第14页 |
| 4 抵抗素的生物学效应 | 第14-20页 |
| ·抵抗素与胰岛素抵抗 | 第14-15页 |
| ·抵抗素与肥胖的关系 | 第15页 |
| ·抵抗素与糖尿病的关系 | 第15-16页 |
| ·抵抗素与高血压的关系 | 第16页 |
| ·抵抗素与动脉粥样硬化 | 第16-17页 |
| ·抵抗素与脑梗死 | 第17页 |
| ·抵抗素与炎症因子 | 第17-18页 |
| ·抵抗素与内皮细胞的关系 | 第18-19页 |
| ·抵抗素与脂肪组织代谢的关系 | 第19页 |
| ·抵抗素与其他脂肪因子 | 第19-20页 |
| ·抵抗素与肝组织的关系 | 第20页 |
| 5 抵抗素基因研究进展 | 第20-21页 |
| 6 研究目的意义 | 第21-22页 |
| 第二部分 试验内容 | 第22-58页 |
| 实验一 牛抵抗素基因的克隆 | 第22-29页 |
| 1 试验材料 | 第22-23页 |
| ·脂肪组织 | 第22页 |
| ·主要的仪器和试剂 | 第22-23页 |
| ·主要的仪器设备 | 第22-23页 |
| ·主要试剂 | 第23页 |
| 2 抵抗素引物的设计与合成 | 第23页 |
| 3 试验方法 | 第23-27页 |
| ·脂肪组织总RNA的提取 | 第23-24页 |
| ·实验准备 | 第23页 |
| ·提取总RNA(Trizol法) | 第23-24页 |
| ·电泳检测 | 第24页 |
| ·反转录(两步法) | 第24-25页 |
| ·PCR扩增 | 第25页 |
| ·PCR产物的凝胶回收 | 第25页 |
| ·连接 | 第25页 |
| ·转化 | 第25-26页 |
| ·大肠杆菌DH5a感受态的制备 | 第25-26页 |
| ·大肠杆菌转化 | 第26页 |
| ·菌液PCR鉴定 | 第26页 |
| ·质粒的提取及双酶切鉴定 | 第26-27页 |
| 4 讨论 | 第27-28页 |
| ·总RNA提取的关键环节 | 第27-28页 |
| ·选取T载体的目的及机理 | 第28页 |
| ·同源性分析 | 第28页 |
| 5 小结 | 第28-29页 |
| 实验二 牛抵抗素基因在毕赤酵母中的表达及鉴定 | 第29-45页 |
| 1 试验材料 | 第29页 |
| 2 主要试验设备与试剂 | 第29-30页 |
| ·主要试验设备 | 第29页 |
| ·主要试剂 | 第29-30页 |
| 3 所用培养基和缓冲液的配制 | 第30-31页 |
| 4 牛抵抗素基因真核表达载体的构建 | 第31-34页 |
| ·目的基因片段的获取与扩增 | 第31-32页 |
| ·目的带与T载体连接 | 第32-33页 |
| ·牛抵抗素基因与真核表达载体pPICZaA的连接 | 第33-34页 |
| ·连接质粒PCR产物的回收及双酶切 | 第33页 |
| ·连接及转化 | 第33-34页 |
| 5 牛抵抗素基因在酵母中表达 | 第34-39页 |
| ·真核表达质粒pPICZaA-resistin的线性化和浓缩 | 第34-35页 |
| ·真核表达质粒的线性化 | 第34-35页 |
| ·真核表达质粒的浓缩 | 第35页 |
| ·酵母感受态的制备及其转化 | 第35-37页 |
| ·酵母感受态的制备 | 第35页 |
| ·毕赤酵母的转化 | 第35页 |
| ·毕赤酵母转化后的PCR鉴定 | 第35-37页 |
| ·酵母基因组DNA的提取(玻璃珠法) | 第36页 |
| ·酵母基因组DNA PCR鉴定 | 第36-37页 |
| ·甲醇诱导表达条件的优化 | 第37-38页 |
| ·甲醇浓度的优化 | 第37-38页 |
| ·诱导表达时间的优化 | 第38页 |
| ·酵母工程菌的大规模诱导表达 | 第38-39页 |
| 6 酵母中表达的重组牛抵抗素目的蛋白的鉴定 | 第39-41页 |
| ·斑点法(Dot-blot)鉴定目的蛋白及其表达量 | 第39-40页 |
| ·目的蛋白的SDS-PAGE鉴定和Western-blot确认 | 第40-41页 |
| 7 目的蛋白的纯化 | 第41-42页 |
| 8 讨论 | 第42-44页 |
| ·酵母表达系统的选取 | 第42-43页 |
| ·转化方法和表达培养基的选取 | 第43页 |
| ·影响牛抵抗素基因表达的因素 | 第43-44页 |
| 9 小结 | 第44-45页 |
| 实验三 重组牛抵抗素生物学活性的鉴定 | 第45-58页 |
| 1 试验材料 | 第45-46页 |
| ·试验动物 | 第45页 |
| ·主要试剂和设备 | 第45页 |
| ·所用培养基和缓冲液的配制 | 第45-46页 |
| 2 试验内容 | 第46-54页 |
| ·重组牛抵抗素对小鼠糖耐量的影响 | 第46-50页 |
| ·试验动物及处理 | 第46页 |
| ·样品采集及处理 | 第46-47页 |
| ·测定结果 | 第47-50页 |
| ·重组牛抵抗素对小鼠血糖浓度的影响 | 第47-48页 |
| ·重组牛抵抗素对小鼠血液胰岛素含量的影响 | 第48-50页 |
| ·重组牛抵抗素对糖异生关键酶PEPCK活性的影响 | 第50-54页 |
| ·犊牛肝细胞的分离培养 | 第50-51页 |
| ·乳酸脱氢酶偶联比色法进行PEPCK酶活性的鉴定 | 第51-53页 |
| ·乳酸脱氢酶偶联比色法进行PEPCK酶活性鉴定的步骤 | 第51-52页 |
| ·重组目的蛋白含量的测定 | 第52-53页 |
| ·鉴定结果 | 第53-54页 |
| 3 讨论 | 第54-57页 |
| ·重组牛抵抗素对小鼠血糖浓度及胰岛素含量的影响 | 第54-55页 |
| ·肝细胞分离培养的影响因素 | 第55页 |
| ·乳酸脱氢酶偶联比色法测酶活性的原理及关键环节 | 第55-56页 |
| ·影响PEPCK活性的机制 | 第56-57页 |
| 4 小结 | 第57-58页 |
| 研究结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
