| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 前言 | 第14-28页 |
| 1.1 昆虫病毒概述及其分类 | 第14页 |
| 1.1.1 昆虫病毒概述 | 第14页 |
| 1.1.2 昆虫病毒的分类 | 第14页 |
| 1.2 浓核病毒 | 第14-19页 |
| 1.2.1 浓核病毒概述及其分类 | 第14-18页 |
| 1.2.2 浓核病毒的基因组结构 | 第18-19页 |
| 1.3 鹿眼蛱蝶浓核病毒JCDNV | 第19-24页 |
| 1.3.1 JcDNV基因组结构特点及其研究进展 | 第19-20页 |
| 1.3.2 JcDNV及其它浓核病毒的转录及基因表达策略 | 第20-22页 |
| 1.3.3 JcDNV及其它浓核病毒侵染宿主的机制 | 第22页 |
| 1.3.4 JcDNV及其它浓核病毒的宿主范围及决定因子 | 第22页 |
| 1.3.5 JcDNV及其它浓核病毒病理学特征 | 第22-23页 |
| 1.3.6 JcDNV及其它浓核病毒在表达载体及生物防治中的应用 | 第23-24页 |
| 1.4 病毒侵入细胞的途径 | 第24-26页 |
| 1.4.1 注射式侵入 | 第24页 |
| 1.4.2 细胞内吞 | 第24-25页 |
| 1.4.3 膜融合 | 第25页 |
| 1.4.4 直接侵入 | 第25-26页 |
| 1.5 研究目的和意义 | 第26-28页 |
| 第二章 鹿眼蛱蝶浓核病毒早期感染机制的研究 | 第28-64页 |
| 2.0 实验材料 | 第28-31页 |
| 2.0.1 病毒、质粒、细胞和供试昆虫 | 第28页 |
| 2.0.2 主要试剂及仪器设备 | 第28-29页 |
| 2.0.3 主要缓冲液与相关试剂及其配置 | 第29-31页 |
| 2.0.3.0 JcDNV感染性克隆pBRJ质粒提取相关试剂的配置 | 第29页 |
| 2.0.3.1 病毒纯化相关溶液配置 | 第29页 |
| 2.0.3.2 Ussing Chambers System相关溶液的配置 | 第29-30页 |
| 2.0.3.3 免疫组化实验相关试剂配置 | 第30页 |
| 2.0.3.4 制备电镜超薄切片的相关溶液 | 第30页 |
| 2.0.3.5 草地贪夜蛾中肠细胞原代培养相关溶液及配置 | 第30-31页 |
| 2.0.3.6 其他试剂 | 第31页 |
| 2.1 实验方法 | 第31-38页 |
| 2.1.1 昆虫的饲养 | 第31页 |
| 2.1.2 提取JcDNV感染性克隆 | 第31页 |
| 2.1.3 JcDNV病毒qPCR标准曲线的绘制 | 第31-33页 |
| 2.1.4 JcDNV病毒的扩增及纯化 | 第33-34页 |
| 2.1.4.1 病毒的扩增 | 第33页 |
| 2.1.4.2 粗病毒液的制备 | 第33页 |
| 2.1.4.3 氯化铯密度梯度离心 | 第33-34页 |
| 2.1.4.4 透析 | 第34页 |
| 2.1.4.5 纯化后病毒粒子的电镜检测 | 第34页 |
| 2.1.5 病毒粒子拷贝数的qPCR测定 | 第34页 |
| 2.1.6 JcDNV对草地贪夜蛾幼虫中肠组织早期感染的分析 | 第34-35页 |
| 2.1.6.1 感染早期中肠样品的获得 | 第34页 |
| 2.1.6.2 中肠组织切片的制备 | 第34-35页 |
| 2.1.6.3 免疫荧光实验 | 第35页 |
| 2.1.7 草地贪夜蛾中肠干细胞的原代培养及感染 | 第35-36页 |
| 2.1.7.1 干细胞的分离培养 | 第35页 |
| 2.1.7.2 JcDNV对于分化细胞的感染及免疫荧光分析 | 第35-36页 |
| 2.1.8 利用Ussing Chammers系统对JcNDV穿透中肠上皮组织运输途径的研究 | 第36-37页 |
| 2.1.9 中肠组织电镜超薄切片的制备 | 第37页 |
| 2.1.10 JcDNV在几种不同鳞翅目昆虫中肠上皮组织中穿透能力的比较 | 第37页 |
| 2.1.11 Jc-wt和Jc-8m对几种不同鳞翅目昆虫中肠上皮组织通透性的影响 | 第37-38页 |
| 2.5 结果与分析 | 第38-61页 |
| 2.5.1 JcDNV病毒的qPCR标准曲线制备 | 第38-39页 |
| 2.5.2 JcDNV病毒粒子CsCl密度梯度离心纯化 | 第39-40页 |
| 2.5.3 JcDNV纯化病毒粒子的qPCR绝对定量测定 | 第40页 |
| 2.5.4 JcDNV感染草地贪夜蛾幼虫中肠上皮组织的早期特点 | 第40-42页 |
| 2.5.5 JcDNV侵染草地贪夜蛾中肠组织的靶细胞类型的研究 | 第42-43页 |
| 2.5.5.1 草地贪夜蛾中肠干细胞的体外分离培养 | 第42页 |
| 2.5.5.2 JcDNV感染中肠干细胞分化细胞的免疫组化分析 | 第42-43页 |
| 2.5.6 JcDNV穿透中肠上皮组织的运输机制研究 | 第43-46页 |
| 2.5.6.1 JcDNV病毒粒子能够迅速穿透中肠上皮组织 | 第44页 |
| 2.5.6.2 激光共聚焦显微镜检测JcDNV穿透中肠组织的细胞内动态分布情况 | 第44-46页 |
| 2.5.7 JcDNV的感染对中肠组织通透性的影响 | 第46-48页 |
| 2.5.8 JcDNV通过跨细胞作用穿透中肠组织 | 第48-55页 |
| 2.5.8.1 鞣酸Tannic acid能够抑制JcDNV穿透中肠上皮组织 | 第48-51页 |
| 2.5.8.2 JcDNV病毒的内化作用与小窝蛋白1和脂筏介导的胞吞作用有关 | 第51-55页 |
| 2.5.9 JcDNV在几种不同鳞翅目昆虫中肠上皮组织中穿透能力的比较 | 第55-57页 |
| 2.5.10 JcDNV衣壳蛋白上四个位点突变损伤了Jc-8m病毒粒子的跨细胞运输而非内化作用 | 第57-60页 |
| 2.5.11 Jc-wt和Jc-8m能够不同程度的提高昆虫中肠上皮组织的通透性 | 第60-61页 |
| 2.6 讨论 | 第61-63页 |
| 2.7 结论 | 第63-64页 |
| 第三章 以家蚕作为新的生物模型来进行JCDNV的病理学分析 | 第64-74页 |
| 3.1 实验材料 | 第64-66页 |
| 3.1.1 病毒、细胞和供试昆虫 | 第64页 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器设备 | 第64-65页 |
| 3.1.3 主要缓冲液与相关试剂及其配置 | 第65-66页 |
| 3.1.3.1 Ussing Chambers System相关溶液的配置 | 第65页 |
| 3.1.3.2 免疫组化实验相关试剂及其配置 | 第65页 |
| 3.1.3.3 组织切片及电镜超薄切片制备相关试剂 | 第65页 |
| 3.1.3.4 其他试剂 | 第65-66页 |
| 3.2 实验方法 | 第66-68页 |
| 3.2.1 昆虫的饲养 | 第66页 |
| 3.2.2 JcDNV病毒的制备及qPCR定量分析 | 第66页 |
| 3.2.3 草地贪夜蛾幼虫半数致死量LD50的测定 | 第66页 |
| 3.2.4 JcDNV感染家蚕幼虫 | 第66页 |
| 3.2.5 家蚕病理学分析 | 第66-67页 |
| 3.2.5.1 组织病理切片观察 | 第66-67页 |
| 3.2.5.2 免疫荧光分析 | 第67页 |
| 3.2.6 家蚕病变组织电镜超薄切片的制备 | 第67-68页 |
| 3.2.7 JcDNV穿过家蚕中肠组织时间及比例的比较分析 | 第68页 |
| 3.3 结果与分析 | 第68-71页 |
| 3.3.1 JcDNV LD50测试结果 | 第68页 |
| 3.3.2 JcDNV对家蚕幼虫的感染及免疫荧光分析 | 第68-69页 |
| 3.3.3 JcDNV感染家蚕后组织电镜检测 | 第69-70页 |
| 3.3.4 JcDNV感染家蚕对其中肠组织通透性的影响 | 第70-71页 |
| 3.4 讨论 | 第71-73页 |
| 3.5 结论 | 第73-74页 |
| 第四章 鹿眼蛱蝶浓核病毒JCDNV转录分析 | 第74-89页 |
| 4.1 材料和方法 | 第74-79页 |
| 4.1.1 质粒、菌株、细胞系等 | 第74页 |
| 4.1.2 试剂、溶液及实验设备 | 第74-75页 |
| 4.1.3 引物设计合成及探针制备 | 第75-76页 |
| 4.1.4 相关质粒的构建 | 第76页 |
| 4.1.5 昆虫细胞Ld652及昆虫幼虫的转染 | 第76页 |
| (1) 转染昆虫细胞Ld652 | 第76页 |
| (2) 转染斜纹夜蛾幼虫 | 第76页 |
| 4.1.6 Trizol法提取Ld652细胞及斜纹夜蛾幼虫的总RNA | 第76-77页 |
| 4.1.7 RT-qPCR检测JcDNV ns1,ns3,Vp基因转录 | 第77-78页 |
| (1) cDNVA第一链的合成 | 第77页 |
| (2) qPCR扩增 | 第77-78页 |
| 4.1.8 Northern blot检测 | 第78页 |
| 4.1.9 SDS-PAGE和western blot分析 | 第78-79页 |
| 4.1.10 免疫荧光检测 | 第79页 |
| 4.2 结果与分析 | 第79-85页 |
| 4.2.1 NS和VP转录物的预测分析及鉴定策略 | 第79-80页 |
| 4.2.2 Northern blot检测 | 第80-81页 |
| 4.2.3 JcDNV VP mRNA翻译产物分析 | 第81-82页 |
| 4.2.4 Northern blot分析JcDNV ns, vp基因转录 | 第82-83页 |
| 4.2.5 RT-qPCR实时定量分析JcDNV NS1,NS3,VP基因转录的动态过程 | 第83-85页 |
| 4.3 讨论 | 第85-88页 |
| 4.4 结论 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-95页 |
| 攻读博士学位期间论文发表情况 | 第95-96页 |
| 致谢 | 第96页 |
