| 中文摘要 | 第6-9页 |
| 英文摘要 | 第9-11页 |
| 前言 | 第12-23页 |
| 一、两类珠蛋白基因簇的表达调控特点 | 第12-14页 |
| 二、LCR在β珠蛋白基因簇表达调控中的作用模式 | 第14-18页 |
| 三、PCE在α珠蛋白基因簇表达调控中的作用模式 | 第18-20页 |
| 四、BAC载体修饰方法的研究进展 | 第20-23页 |
| 材料与方法 | 第23-47页 |
| 一、实验材料 | 第23-25页 |
| 1.BAC克隆 | 第23页 |
| 2.菌株与质粒 | 第23-24页 |
| 3.实验用小鼠 | 第24页 |
| 4.限制性内切酶及修饰酶 | 第24页 |
| 5.其它主要试剂 | 第24页 |
| 6.放射性核素 | 第24-25页 |
| 7.主要仪器 | 第25页 |
| 二、实验方法 | 第25-47页 |
| 1.BAC介导的人珠蛋白基因簇转基因鼠的基本技术路线 | 第25-26页 |
| 2.从BAC186D7 DNA中定位删除IL-11受体α链基因 | 第26-31页 |
| 2.1 克隆策略 | 第27-28页 |
| 2.2 BAC186D7中IL-11受体α链基因与β-珠蛋白基因簇接头部位确定 | 第28-30页 |
| 2.2.1 BAC DNA的小量制备 | 第28页 |
| 2.2.2 DNA探针的标记 | 第28页 |
| 2.2.3 Southern杂交 | 第28-29页 |
| 2.2.4 CaCL_2法制备感受态细胞 | 第29页 |
| 2.2.5 菌落原位杂交 | 第29-30页 |
| 2.3 用于重组的穿梭载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.3.1 同源突变盒片段的扩增及纯化 | 第30页 |
| 2.3.2 用试剂盒回收DNA片段 | 第30页 |
| 2.3.3 连接反应 | 第30页 |
| 2.3.4 感受态细胞的快速转化 | 第30-31页 |
| 2.4 含有BAC DNA的感受态细胞的制备 | 第31页 |
| 2.5 感受态细胞的转化及重组体的正-筛选 | 第31页 |
| 2.6 负筛选确定突变BAC克隆 | 第31页 |
| 2.7 PFGE分析IL-11受体α链基因被定位BAC克隆 | 第31页 |
| 3.利用ET Cloning技术构建含LCR与α结构基因的BAC克隆 | 第31-37页 |
| 3.1 克隆策略 | 第31-33页 |
| 3.2 卡那抗性基因的扩增 | 第33页 |
| 3.3 电转用感受态细胞的制备 | 第33-34页 |
| 3.4 含BAC186D7及BAC191K2的电转用感受态细胞的制备 | 第34页 |
| 3.5 RecE,RecT介导同源重组 | 第34页 |
| 3.6 PFGE分析发生同源重组后的BAC克隆 | 第34页 |
| 3.7 BAC DNA的大量制备 | 第34-35页 |
| 3.8 大片段DNA的回收纯化 | 第35页 |
| 3.8.1 沟槽电泳回收法 | 第35页 |
| 3.8.2 琼脂糖酶消化回收法 | 第35页 |
| 3.9 大片段DNA的连接转化 | 第35页 |
| 3.10 含LCR与α结构基因的BAC克隆的鉴定 | 第35-37页 |
| 3.10.1 克隆完整性鉴定 | 第35-36页 |
| 3.10.2 克隆方向性鉴定 | 第36-37页 |
| 4.显微注射用BAC DNA的制备与纯化 | 第37页 |
| 5.受精卵培养基的配制与保存 | 第37页 |
| 6.小鼠的选择与处理 | 第37-39页 |
| 7.超排卵和取卵 | 第39页 |
| 8.显微注射 | 第39-41页 |
| 9.输卵管移卵 | 第41页 |
| 10.胚胎小鼠器官组织的采集和保存 | 第41-42页 |
| 11.鼠尾基因组DNA的提取 | 第42页 |
| 12.利用PCR和Southern杂交鉴定转基因鼠 | 第42-43页 |
| 13.阳性胎鼠的PCR快速鉴定 | 第43页 |
| 14.转基因鼠传代 | 第43页 |
| 15.组织RNA提取 | 第43-44页 |
| 16.RNase保护实验检测转基因鼠中人珠蛋白转基因的表达 | 第44-47页 |
| 16.1 RNA探针标记 | 第44页 |
| 16.2 RNA探针的纯化 | 第44-45页 |
| 16.3 RNA:RNA杂交 | 第45页 |
| 16.4 RNase反应、变性胶电泳及放射自显影 | 第45-47页 |
| 实验结果 | 第47-68页 |
| 一、从BAC186D7 DNA中定位删除IL-11受体α链基因 | 第47-52页 |
| 1.BAC186D7中β-珠蛋白基因簇与IL-11受体α链基因接头部位确定 | 第47-48页 |
| 2.用于重组的穿梭载体pSV-AB的构建 | 第48-50页 |
| 3 穿梭载体在大肠杆菌细胞中的同源重组及重组体的正负筛选 | 第50页 |
| 4.PFGE鉴定发生同源重组后的BAC克隆 | 第50-52页 |
| 二、利用ET Cloning技术构建含LCR与α结构基因的BAC克隆 | 第52-57页 |
| 1.卡那抗性基因的扩增 | 第52页 |
| 2.PFGE鉴定发生同源重组后的BAC克隆 | 第52-53页 |
| 3.含LCR与α结构基因的BAC克隆的鉴定 | 第53-57页 |
| 3.1 克隆完整性鉴定 | 第53页 |
| 3.2 克隆方向性鉴定 | 第53-57页 |
| 三、显微注射用BAC DNA的制备与纯化 | 第57-58页 |
| 四、转基因鼠系的建立 | 第58-68页 |
| 1.βD转基因鼠系的建立 | 第58-60页 |
| 2.βD转基因鼠中人β-珠蛋白基因表达分析 | 第60-62页 |
| 3.ex-Ⅰ转基因鼠系的建立 | 第62-63页 |
| 3.1 PCR鉴定 | 第62页 |
| 3.2 Southern分析 | 第62-63页 |
| 4.ex-Ⅰ转基因鼠中人α-珠蛋白基因表达分析 | 第63-68页 |
| 讨论 | 第68-77页 |
| 一、BAC载体在转基因动物研究中的应用及改良的ET Cloning同源重组技术的应用前景 | 第68-70页 |
| 二、βD转基因鼠系的建立 | 第70-71页 |
| 三、LCR对α-类珠蛋白基因表达的影响 | 第71-77页 |
| 小结 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-88页 |
| 文献综述 | 第88-97页 |
| 英文名词及缩写 | 第97-99页 |
| 致谢 | 第99-100页 |
| 个人简历 | 第100页 |
