| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词及中英文对照 | 第7-15页 |
| 1 前言 | 第15-21页 |
| 1.1 香蕉枯萎病概况 | 第15-16页 |
| 1.1.1 香蕉产业及其重要性 | 第15页 |
| 1.1.2 香蕉枯萎病的发生与危害情况 | 第15-16页 |
| 1.2 香蕉枯萎病的防治现状 | 第16-17页 |
| 1.2.1 化学防治 | 第16页 |
| 1.2.2 抗病品种的选育 | 第16-17页 |
| 1.2.3 生物防治 | 第17页 |
| 1.2.4 其他防治方法 | 第17页 |
| 1.3 植物病原菌分泌的细胞壁降解酶 | 第17-18页 |
| 1.4 果胶甲酯酶研究进展 | 第18-20页 |
| 1.5 研究目的与意义 | 第20-21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-60页 |
| 2.1 主要仪器和设备 | 第21页 |
| 2.2 主要试剂 | 第21-22页 |
| 2.3 供试菌株 | 第22页 |
| 2.4 供试植物 | 第22页 |
| 2.5 宿主菌 | 第22页 |
| 2.6 质粒载体 | 第22页 |
| 2.7 主要培养基和溶液的配置 | 第22-26页 |
| 2.8 试验方法 | 第26-60页 |
| 2.8.1 pme1和pme2相对表达情况 | 第26-29页 |
| 2.8.1.1 香蕉枯萎病菌1号和4号小种接种香蕉根部 | 第26页 |
| 2.8.1.2 香蕉根部总RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.8.1.3 c DNA第一链的合成 | 第27页 |
| 2.8.1.4 Real-time PCR引物设计 | 第27-28页 |
| 2.8.1.5 Real-time PCR反应 | 第28-29页 |
| 2.8.2 pme1和pme2的克隆 | 第29-37页 |
| 2.8.2.1 香蕉枯萎病菌1号和4号小种基因组DNA提取 | 第29-30页 |
| 2.8.2.2 香蕉枯萎病菌1号和4号小种RNA提取 | 第30-31页 |
| 2.8.2.3 基因克隆引物设计 | 第31页 |
| 2.8.2.4 香蕉枯萎病菌1号和4号小种pme1和pme2基因DNA的扩增 | 第31-32页 |
| 2.8.2.5 香蕉枯萎病菌1号和4号小种pme1和pme2基因c DNA的扩增 | 第32-33页 |
| 2.8.2.6 PCR产物的回收 | 第33-34页 |
| 2.8.2.7 宿主菌E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第34页 |
| 2.8.2.8 回收产物的连接转化、蓝白斑筛选转化子 | 第34-35页 |
| 2.8.2.9 单菌落PCR筛选阳性克隆 | 第35-36页 |
| 2.8.2.10 阳性克隆质粒的抽提及测序 | 第36页 |
| 2.8.2.11 生物信息学分析 | 第36-37页 |
| 2.8.3 pme1和pme2真核表达载体构建 | 第37-48页 |
| 2.8.3.1 真核表达载体构建路线 | 第37-38页 |
| 2.8.3.2 真核表达引物设计 | 第38页 |
| 2.8.3.3 pme1和pme2的扩增和PCR产物的回收 | 第38页 |
| 2.8.3.4 回收产物的连接转化、蓝白斑筛选转化子 | 第38页 |
| 2.8.3.5 单菌落PCR筛选阳性克隆 | 第38页 |
| 2.8.3.6 阳性克隆质粒的抽提及测序 | 第38页 |
| 2.8.3.7 质粒的限制性内切酶消化 | 第38-39页 |
| 2.8.3.8 酶切产物的纯化回收 | 第39页 |
| 2.8.3.9 酶切产物的连接 | 第39页 |
| 2.8.3.10 酶切产物的转化 | 第39-40页 |
| 2.8.3.11 单菌落PCR筛选阳性克隆 | 第40页 |
| 2.8.3.12 初筛阳性克隆的抽提、酶切鉴定和测序 | 第40页 |
| 2.8.3.13 酵母感受态的制备 | 第40页 |
| 2.8.3.14 线性化重组表达质粒的制备 | 第40-41页 |
| 2.8.3.15 电击转化酵母感受态Pichiapastoris GS115 | 第41页 |
| 2.8.3.16 酵母基因组提取 | 第41-42页 |
| 2.8.3.17 转化子PCR鉴定 | 第42页 |
| 2.8.3.18 转化子的诱导表达 | 第42-43页 |
| 2.8.3.19 表达产物SDS-PAGE电泳分析 | 第43-45页 |
| 2.8.3.20 表达产物的浓缩 | 第45页 |
| 2.8.3.21 浓缩蛋白的浓度测定 | 第45-46页 |
| 2.8.3.22 Western Blot检测重组蛋白 | 第46-47页 |
| 2.8.3.23 重组蛋白酶活测定 | 第47-48页 |
| 2.8.4 PME1、PME2同工酶功能验证 | 第48-60页 |
| 2.8.4.1 hi TAIL-PCR扩增pme1、pme2上下游同源片段 | 第48-51页 |
| 2.8.4.2 基因敲除引物的设计 | 第51-52页 |
| 2.8.4.3 pme1和pme2基因敲除载体构建 | 第52-53页 |
| 2.8.4.4 根癌农杆菌感受态细胞的制备 | 第53页 |
| 2.8.4.5 敲除载体质粒电击转化根癌农杆菌 | 第53-54页 |
| 2.8.4.6 ATMT介导转化 | 第54页 |
| 2.8.4.7 Southern杂交鉴定 | 第54-57页 |
| 2.8.4.8 pme1和pme2同工酶基因敲除突变体的分析 | 第57-58页 |
| 2.8.4.9 pme1和pme2同工酶基因敲除突变体的致病性测定 | 第58-60页 |
| 3 结果与分析 | 第60-108页 |
| 3.1 pme1和pme2基因相对表达情况 | 第60-63页 |
| 3.2 基因克隆及生物信息学分析 | 第63-81页 |
| 3.2.1 香蕉枯萎病菌1号和4号小种总DNA的提取 | 第63页 |
| 3.2.2 香蕉枯萎病菌1号和4号小种RNA的提取 | 第63-64页 |
| 3.2.3 pme1和pme2基因DNA与c DNA的扩增与克隆 | 第64-65页 |
| 3.2.3.1 pme1基因DNA的扩增与克隆 | 第64页 |
| 3.2.3.2 pme2基因DNA的扩增与克隆 | 第64-65页 |
| 3.2.3.3 pme1和pme2基因c DNA的扩增与克隆 | 第65页 |
| 3.2.4 pme1和pme2基因c DNA与DNA序列分析 | 第65-81页 |
| 3.2.4.1 Foc1-pme1和Foc4-pme1核苷酸及氨基酸序列比对分析 | 第65-67页 |
| 3.2.4.2 Foc1-pme2和Foc4-pme2核苷酸及氨基酸序列比对分析 | 第67-69页 |
| 3.2.4.3 Foc1-pme1和Foc4-pme1编码蛋白的理化性质分析 | 第69-70页 |
| 3.2.4.4 Foc1-pme1和Foc4-pme1编码蛋白的理化性质分析 | 第70-71页 |
| 3.2.4.5 pme1和pme2编码蛋白功能域预测及活性位点分析 | 第71-76页 |
| 3.2.4.6 pme1和pme2编码蛋白二级结构预测分析 | 第76-79页 |
| 3.2.4.7 pme1和pme2编码蛋白三级结构预测分析 | 第79-81页 |
| 3.3 pme1和pme2真核表达 | 第81-90页 |
| 3.3.1 pme1和pme2基因c DNA的提取 | 第81页 |
| 3.3.2 重组质粒p PICZαA-pme菌落PCR鉴定 | 第81-82页 |
| 3.3.3 重组质粒p PICZαA-pme双酶切鉴定 | 第82-83页 |
| 3.3.4 线性化表达载体Sac I单酶切线性化 | 第83-84页 |
| 3.3.5 pme酵母转化子PCR | 第84-85页 |
| 3.3.6 Western blot检测目的蛋白 | 第85-86页 |
| 3.3.7 真核表达SDS-PAGE分析 | 第86-88页 |
| 3.3.8 表达产物的蛋白浓度测定 | 第88页 |
| 3.3.9 重组蛋白酶活测定 | 第88-90页 |
| 3.4 pme1和pme2基因敲除 | 第90-108页 |
| 3.4.1 hiTAIL-PCR扩增pme1上下游序列 | 第90-91页 |
| 3.4.2 hiTAIL-PCR扩增pme2上下游序列 | 第91-92页 |
| 3.4.3 pme1和pme2敲除载体构建 | 第92-97页 |
| 3.4.3.1 pme1敲除载体PCR检测 | 第92-93页 |
| 3.3.3.2 pme1敲除载体双酶切鉴定 | 第93-94页 |
| 3.3.3.3 pme2敲除载体PCR检测 | 第94-96页 |
| 3.3.3.4 pme2敲除载体双酶切鉴定 | 第96-97页 |
| 3.4.4 pme1和pme2重组敲除质粒转化根癌农杆菌AGL1 | 第97-99页 |
| 3.4.4.1 pme1重组敲除质粒转化根癌农杆菌AGL1检测 | 第97-98页 |
| 3.4.4.2 pme2重组敲除质粒转化根癌农杆菌AGL1检测 | 第98-99页 |
| 3.4.5 敲除突变体PCR检测 | 第99-101页 |
| 3.4.6 pme1、pme2敲除突变体的Southern Blot检测 | 第101-102页 |
| 3.4.7 PME1和PME2同工酶敲除突变体的表型 | 第102-103页 |
| 3.4.8 PME1和PME2同工酶敲除突变体的遗传稳定性 | 第103页 |
| 3.4.9 PME1和PME2同工酶敲除突变体的产孢子能力测定 | 第103-106页 |
| 3.4.10 PME1和PME2同工酶敲除突变体的致病性验证 | 第106-108页 |
| 4 结论与讨论 | 第108-116页 |
| 4.1 结论 | 第108-111页 |
| 4.1.1 pme1、pme2 Real-time PCR验证 | 第108页 |
| 4.1.2 PME1、PME2同工酶基因克隆及生物信息学分析 | 第108-109页 |
| 4.1.3 PME1、PME2同工酶基因的真核表达 | 第109-110页 |
| 4.1.4 PME1、PME2同工酶基因的功能验证 | 第110-111页 |
| 4.2 讨论 | 第111-115页 |
| 4.3 展望 | 第115-116页 |
| 致谢 | 第116-117页 |
| 参考文献 | 第117-124页 |
| 附录A 香蕉枯萎病菌2小种PME同工酶基因的核苷酸序列 | 第124-126页 |
