| 中文摘要 | 第3-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 符号说明 | 第16-18页 |
| 文献综述 | 第18-33页 |
| 一、产肠毒素大肠杆菌菌毛F4及其受体的研究进展 | 第18-26页 |
| 1 ETEC F4菌毛结构和功能 | 第18-20页 |
| 2 F4菌毛受体 | 第20-26页 |
| 2.1 F4相关受体的发现 | 第21页 |
| 2.2 F4相关受体基因的研究 | 第21-24页 |
| 2.3 F4相关受体的生化特性 | 第24-25页 |
| 2.4 F4特异性受体猪源氨肽酶N的研究 | 第25-26页 |
| 二、本研究的背景和意义 | 第26页 |
| 参考文献 | 第26-33页 |
| 实验部分 | 第33-158页 |
| 第一章 猪产肠毒素大肠杆菌F4相关受体的初步分型 | 第33-46页 |
| 1 材料 | 第34-35页 |
| 2 方法 | 第35-38页 |
| 2.1 扩增MUC4 intron 7基因所需引物的设计 | 第35页 |
| 2.2 样品的制备 | 第35页 |
| 2.3 PCR扩增目的基因片段 | 第35-36页 |
| 2.4 酶切鉴定PCR产物 | 第36页 |
| 2.5 ETEC F4菌毛蛋白的制备与纯化 | 第36-37页 |
| 2.6 ETEC F4的生物素化处理 | 第37页 |
| 2.7 刷状缘大分子(BBV)细胞的制备 | 第37-38页 |
| 2.8 BBV蛋白的检测 | 第38页 |
| 2.9 BBV细胞的体外粘附及粘附抑制实验 | 第38页 |
| 3 结果 | 第38-43页 |
| 3.1 PCR扩增MUC4内含子7基因 | 第38-39页 |
| 3.2 酶切验证鉴定 | 第39-41页 |
| 3.3 F4菌毛蛋白的表达 | 第41页 |
| 3.4 Dot-blot分析BBV蛋白与生物素化F4菌毛的结合 | 第41-42页 |
| 3.5 猪的黏附表型鉴定结果 | 第42-43页 |
| 4 讨论 | 第43-44页 |
| 参考文献 | 第44-46页 |
| 第二章 猪源氨肽酶N基因的克隆和表达系统的构建 | 第46-67页 |
| 1 材料 | 第47-48页 |
| 2 方法 | 第48-58页 |
| 2.1 F4ac菌毛单抗的制备 | 第48-50页 |
| 2.2 扩增APN全长基因所需引物的设计 | 第50-51页 |
| 2.3 样品的制备 | 第51页 |
| 2.4 总RNA的提取 | 第51页 |
| 2.5 基因组DNA的去除 | 第51页 |
| 2.6 cDNA的制备 | 第51-52页 |
| 2.7 PCR扩增反应及产物纯化 | 第52-54页 |
| 2.8 化学感受态细胞的制备 | 第54页 |
| 2.9 连接与转化 | 第54页 |
| 2.10 阳性克隆的筛选及测序 | 第54页 |
| 2.11 表达载体的构建 | 第54-55页 |
| 2.12 APN蛋白的表达与纯化 | 第55-57页 |
| 2.13 APN多抗的制备 | 第57页 |
| 2.14 间接免疫荧光 | 第57-58页 |
| 2.15 Western-blot鉴定蛋白表达 | 第58页 |
| 3 结果 | 第58-64页 |
| 3.1 F4单抗的效价和特异性 | 第58-59页 |
| 3.2 PCR扩增 | 第59-60页 |
| 3.3 APN原核表达质粒的酶切鉴定和测序鉴定 | 第60页 |
| 3.4 APN真核表达质粒的酶切鉴定和测序鉴定 | 第60-61页 |
| 3.5 APN的原核表达和蛋白的纯化 | 第61-63页 |
| 3.6 APN多抗血清效价测定 | 第63页 |
| 3.7 APN蛋白表达的鉴定 | 第63-64页 |
| 4 讨论 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-67页 |
| 第三章 FaeG介导猪源氢肽酶N(APN)与产肠毒素大肠杆菌ETEC F4~+的黏附 | 第67-89页 |
| 1 材料 | 第68页 |
| 2 方法 | 第68-77页 |
| 2.1 引物设计 | 第68-69页 |
| 2.2 大肠杆菌F4模板的制备 | 第69页 |
| 2.3 大肠杆菌F4~+pBR322-fae(faeC to faeJ)重组菌的构建 | 第69-71页 |
| 2.4 细胞生长曲线测定(MTT实验) | 第71页 |
| 2.5 细菌的黏附和黏附抑制实验 | 第71-72页 |
| 2.6 玻板凝集实验 | 第72页 |
| 2.7 APN蛋白与FaeG的相互作用 | 第72-77页 |
| 3 结果 | 第77-85页 |
| 3.1 pBR322-fae重组菌的鉴定 | 第77-78页 |
| 3.2 细胞生长曲线 | 第78页 |
| 3.3 黏附实验结果 | 第78-80页 |
| 3.4 黏附抑制实验结果 | 第80-81页 |
| 3.5 凝集反应结果 | 第81-82页 |
| 3.6 APN蛋白与FaeG蛋白的相互作用 | 第82-85页 |
| 4 讨论 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-89页 |
| 第四章 猪氨肽酶N对产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4黏附力的影响 | 第89-112页 |
| 1 材料 | 第90-91页 |
| 2 方法 | 第91-101页 |
| 2.1 引物设计 | 第91-92页 |
| 2.2 筛选G418最小致死浓度 | 第92页 |
| 2.3 RNAi干扰质粒的构建 | 第92-94页 |
| 2.4 筛选Blasticidin最小致死浓度 | 第94页 |
| 2.5 pEC129-APN过表达载体的构建 | 第94-95页 |
| 2.6 转染条件的优化 | 第95-96页 |
| 2.7 转染和筛选 | 第96页 |
| 2.8 设立阳性对照 | 第96-97页 |
| 2.9 APN蛋白活性检测 | 第97-98页 |
| 2.10 Western-blot鉴定APN表达 | 第98页 |
| 2.11 荧光定量检测APN mRNA的表达量 | 第98-99页 |
| 2.12 细胞的免疫组化实验 | 第99-100页 |
| 2.13 细菌的内化试验 | 第100-101页 |
| 2.14 细菌的黏附试验 | 第101页 |
| 3 结果 | 第101-108页 |
| 3.1 APN真核表达质粒的酶切鉴定和测序鉴定 | 第101-102页 |
| 3.2 荧光定量检测mRNA水平上APN的表达量 | 第102-103页 |
| 3.3 APN蛋白的酶活性检测 | 第103页 |
| 3.4 Western-blotting结果(以IPEC-J2细胞为例) | 第103-104页 |
| 3.5 不同细胞系的免疫组化结果分析 | 第104-105页 |
| 3.6 细胞内化实验结果分析 | 第105-106页 |
| 3.7 黏附实验结果分析 | 第106-108页 |
| 4 讨论 | 第108页 |
| 参考文献 | 第108-112页 |
| 第五章 猪源氨肽酶N功能结合域的研究 | 第112-142页 |
| 1 材料 | 第113-114页 |
| 2 方法 | 第114-121页 |
| 2.1 APN基因的进化树分析和氨基酸比对 | 第114-115页 |
| 2.2 引物设计 | 第115-116页 |
| 2.3 APN BDΔ1/BDΔ2/BDΔ3/BDΔ4/BDΔ5蛋白的原核表达 | 第116页 |
| 2.4 Western-blot验证分区段蛋白的特异性 | 第116-117页 |
| 2.5 Pull-Down实验 | 第117页 |
| 2.6 多肽阵列 | 第117-120页 |
| 2.7 APN与FaeG蛋白功能性结合域的验证 | 第120-121页 |
| 3 结果 | 第121-136页 |
| 3.1 pET28a-APN BDΔ1/BD△2/BD△3/BD△4/BD△5的鉴定 | 第121-122页 |
| 3.2 SDS-PAGE和Western验证APN分段表达 | 第122-123页 |
| 3.3 多肽阵列结果 | 第123-132页 |
| 3.4 APN和FaeG蛋白的功能性结合域 | 第132-136页 |
| 4 讨论 | 第136-138页 |
| 参考文献 | 第138-142页 |
| 第六章 锌离子(Zn~(2+))对猪源氨肽酶功能的影响 | 第142-158页 |
| 1 材料 | 第143-144页 |
| 2 方法 | 第144-148页 |
| 2.1 荧光定量PCR引物设计 | 第144-145页 |
| 2.2 APN蛋白的活性检测 | 第145页 |
| 2.3 细菌黏附实验 | 第145-146页 |
| 2.4 细菌感染实验 | 第146页 |
| 2.5 Western-blot实验 | 第146-147页 |
| 2.6 荧光定量检测细胞因子的表达量 | 第147页 |
| 2.7 锌离子螯合缺陷培养实验 | 第147页 |
| 2.8 细胞因子的ELISA检测 | 第147-148页 |
| 3 结果 | 第148-154页 |
| 3.1 APN蛋白的活性检测结果 | 第148页 |
| 3.2 黏附实验结果 | 第148-149页 |
| 3.3 Western-blot实验结果 | 第149-152页 |
| 3.4 荧光定量检测细胞因子 | 第152-153页 |
| 3.5 细胞因子的ELISA检测结果 | 第153-154页 |
| 4 讨论 | 第154-155页 |
| 参考文献 | 第155-158页 |
| 全文小结 | 第158-160页 |
| 论文创新点 | 第160-161页 |
| 致谢 | 第161-162页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第162-163页 |
| 学术交流及报告 | 第163页 |
| 主持和参与的研究课题 | 第163-165页 |
