| 中文摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第7-12页 |
| 第一部分 文献综述及选题背景 | 第12-17页 |
| 1 鸭坦布苏病毒概述 | 第12-13页 |
| 2 鸭坦布苏病的检测 | 第13-14页 |
| 3 胶体金免疫层析技术 | 第14-16页 |
| 3.1 GICA原理简介 | 第14-15页 |
| 3.2 GICA在动物病毒检测方面的应用 | 第15-16页 |
| 4 选题意义 | 第16-17页 |
| 第二部分 试验研究 | 第17-56页 |
| 第一章 鸭坦布苏病毒的纯化、形态学观察及其高免血清制备 | 第18-24页 |
| 1 材料 | 第18-19页 |
| 1.1 毒株与动物 | 第18页 |
| 1.2 主要仪器 | 第18页 |
| 1.3 主要试剂 | 第18页 |
| 1.4 溶液配制 | 第18-19页 |
| 2 方法 | 第19-20页 |
| 2.1 病毒增殖 | 第19页 |
| 2.2 病毒纯化 | 第19页 |
| 2.2.1 病毒浓缩 | 第19页 |
| 2.2.2 蔗糖密度梯度超速离心纯化病毒 | 第19页 |
| 2.3 病毒形态学观察 | 第19-20页 |
| 2.4 病毒含量测定 | 第20页 |
| 2.5 鸭抗DTMUV免疫血清制备 | 第20页 |
| 2.5.1 免疫抗原的制备 | 第20页 |
| 2.5.2 免疫程序 | 第20页 |
| 2.5.3 效价测定 | 第20页 |
| 3 结果 | 第20-22页 |
| 3.1 病毒纯化 | 第20-21页 |
| 3.2 病毒形态学观察 | 第21页 |
| 3.3 病毒含量测定 | 第21-22页 |
| 3.4 抗体效价测定 | 第22页 |
| 4 讨论 | 第22-23页 |
| 5 小结 | 第23-24页 |
| 第二章 鸭坦布苏病毒截短E基因的克隆表达 | 第24-36页 |
| 1 材料 | 第24-26页 |
| 1.1 毒株、菌株 | 第24页 |
| 1.2 主要仪器 | 第24页 |
| 1.3 主要试剂 | 第24-25页 |
| 1.4 溶液配制 | 第25-26页 |
| 1.4.1 琼脂糖凝胶电泳溶液 | 第25页 |
| 1.4.2 SDS-PAGE电泳溶液 | 第25页 |
| 1.4.3 Ni柱亲和层析溶液 | 第25-26页 |
| 1.4.4 免疫印迹溶液 | 第26页 |
| 2 方法 | 第26-31页 |
| 2.1 引物设计 | 第26页 |
| 2.2 目的基因扩增 | 第26-27页 |
| 2.2.1 DTMUV总RNA提取 | 第26页 |
| 2.2.2 cDNA的合成 | 第26页 |
| 2.2.3 目的E基因的PCR扩增 | 第26-27页 |
| 2.2.4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 | 第27页 |
| 2.2.5 PCR产物回收纯化 | 第27页 |
| 2.3 目的E基因TA克隆 | 第27-28页 |
| 2.3.1 连接反应 | 第27页 |
| 2.3.2 大肠杆菌感受态细胞制备 | 第27页 |
| 2.3.3 连接产物的转化 | 第27页 |
| 2.3.4 重组质粒pGM-T-E抽提 | 第27页 |
| 2.3.5 重组质粒pGM-T-E酶切鉴定 | 第27-28页 |
| 2.4 原核表达重组质粒构建 | 第28-29页 |
| 2.4.1 双酶切与胶回收 | 第28页 |
| 2.4.2 连接反应 | 第28页 |
| 2.4.3 连接产物的转化 | 第28页 |
| 2.4.4 重组表达质粒pET-32a-E鉴定 | 第28-29页 |
| 2.5 重组表达质粒诱导表达 | 第29-30页 |
| 2.5.1 重组质粒pET-32a-E的转化 | 第29页 |
| 2.5.2 重组质粒pET-32a-E的诱导表达 | 第29页 |
| 2.5.3 SDS-PAGE电泳 | 第29页 |
| 2.5.4 表达条件优化 | 第29-30页 |
| 2.6 原核重组蛋白纯化 | 第30页 |
| 2.6.1 重组蛋白可溶性分析 | 第30页 |
| 2.6.2 重组蛋白的纯化 | 第30页 |
| 2.6.3 重组蛋白复性和浓缩 | 第30页 |
| 2.7 Western-blot分析 | 第30-31页 |
| 3 结果 | 第31-34页 |
| 3.1 截短E基因PCR扩增 | 第31页 |
| 3.2 重组表达质粒构建 | 第31-32页 |
| 3.3 重组表达质粒诱导表达 | 第32-33页 |
| 3.3.1 pET-32a-E的诱导表达 | 第32页 |
| 3.3.2 pET-32a-E表达条件优化 | 第32-33页 |
| 3.4 重组蛋白纯化 | 第33-34页 |
| 3.4.1 可溶性分析 | 第33页 |
| 3.4.2 蛋白纯化 | 第33-34页 |
| 3.5 Western-blot分析 | 第34页 |
| 4 讨论 | 第34-35页 |
| 5 小结 | 第35-36页 |
| 第三章 检测鸭坦布苏病毒血清抗体的胶体金免疫层析试纸条的研制与应用 | 第36-56页 |
| 1 材料 | 第36-37页 |
| 1.1 血清 | 第36页 |
| 1.2 主要仪器 | 第36页 |
| 1.3 主要试剂和材料 | 第36-37页 |
| 1.4 主要溶液配制 | 第37页 |
| 2 方法 | 第37-42页 |
| 2.1 玻璃器皿处理 | 第37页 |
| 2.2 胶体金溶液质量鉴定 | 第37-38页 |
| 2.2.1 肉眼观察 | 第37页 |
| 2.2.2 紫外扫描鉴定 | 第37-38页 |
| 2.2.3 胶体金稳定性鉴定 | 第38页 |
| 2.3 金标E蛋白制备 | 第38-39页 |
| 2.3.1 重组E蛋白预处理 | 第38页 |
| 2.3.2 胶体金溶液的准备 | 第38页 |
| 2.3.3 胶体金标记重组E蛋白最适pH值选择 | 第38-39页 |
| 2.3.4 胶体金标记E蛋白最适量的选择 | 第39页 |
| 2.4 金标羊抗鼠IgG制备 | 第39页 |
| 2.5 免疫胶体金鉴定和纯化 | 第39-40页 |
| 2.5.1 免疫胶体金鉴定 | 第39-40页 |
| 2.5.2 免疫胶体金的纯化 | 第40页 |
| 2.6 胶体金试纸条初步组装及鉴定 | 第40页 |
| 2.7 试纸条反应条件优化 | 第40-41页 |
| 2.7.1 试纸条组成材料选择 | 第40-41页 |
| 2.7.2 金标复合物稀释液和稀释倍数选择 | 第41页 |
| 2.7.3 检测线和质控线包被浓度优化 | 第41页 |
| 2.8 免疫层析试纸条性能测定 | 第41-42页 |
| 2.8.1 特异性试验 | 第41页 |
| 2.8.2 敏感性试验 | 第41-42页 |
| 2.8.3 重复性试验 | 第42页 |
| 2.8.4 对比试验 | 第42页 |
| 2.8.5 稳定性试验 | 第42页 |
| 3 结果 | 第42-53页 |
| 3.1 胶体金溶液质量鉴定 | 第42-43页 |
| 3.2 金标E蛋白制备 | 第43-45页 |
| 3.2.1 金标E蛋白最适标记pH选择 | 第43-44页 |
| 3.2.2 金标E蛋白最适蛋白标记量选择 | 第44-45页 |
| 3.3 金标羊抗鼠IgG制备 | 第45-46页 |
| 3.3.1 金标羊抗鼠IgG最适标记pH选择 | 第45页 |
| 3.3.2 金标羊抗鼠IgG最适抗体标记量选择 | 第45-46页 |
| 3.4 免疫胶体金的鉴定 | 第46页 |
| 3.5 试纸条初步组装及鉴定 | 第46-47页 |
| 3.6 试纸条反应条件的优化 | 第47-51页 |
| 3.6.1 层析膜的选择 | 第47-48页 |
| 3.6.2 金标垫的选择 | 第48-49页 |
| 3.6.3 样品垫的选择 | 第49页 |
| 3.6.4 吸收垫的选择 | 第49页 |
| 3.6.5 金标复合物稀释液和稀释倍数的选择 | 第49-50页 |
| 3.6.6 检测线和质控线包被浓度优化 | 第50-51页 |
| 3.7 免疫层析试纸条的性能测定 | 第51-53页 |
| 3.7.1 特异性试验 | 第51页 |
| 3.7.2 敏感性试验 | 第51页 |
| 3.7.3 重复性试验 | 第51-52页 |
| 3.7.4 对比试验 | 第52页 |
| 3.7.5 稳定性试验 | 第52-53页 |
| 4 讨论 | 第53-54页 |
| 5 小结 | 第54-56页 |
| 结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 个人简历及完成的学术论文目录 | 第66页 |