| 中文摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 英文缩写对照表(Abbreviation table) | 第8-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-23页 |
| 1 TNF-α的来源和分布 | 第13-14页 |
| 1.1 TNF-α的来源 | 第13-14页 |
| 1.2 TNF-α的分布 | 第14页 |
| 2 TNF-α的结构与生物活性 | 第14-16页 |
| 2.1 TNF-α的结构 | 第14-15页 |
| 2.2 TNF-α的一般性质和生物学活性 | 第15-16页 |
| 2.2.1 一般性质 | 第15-16页 |
| 2.2.2 生物学活性 | 第16页 |
| 3 TNF-α的信号转导 | 第16-18页 |
| 3.1 TNFR途径 | 第16-17页 |
| 3.2 核因子kB(NF-kB)途径 | 第17页 |
| 3.3 磷酸二酯酶4(PDE4)途径 | 第17页 |
| 3.4 TACE途径 | 第17-18页 |
| 3.5 p38丝裂活化蛋白激酶(p38 MAPK)途径 | 第18页 |
| 4 TNF-α与疾病的关系 | 第18-21页 |
| 4.1 TNF-α与类风湿关节炎 | 第18-19页 |
| 4.2 TNF-α与强直性脊髓炎 | 第19页 |
| 4.3 TNF-α与充血性心力衰竭 | 第19-20页 |
| 4.4 TNF-α与肿瘤 | 第20-21页 |
| 5 猕猴川西亚种简介 | 第21页 |
| 6 猕猴川西亚种TNF-α的研究目的意义 | 第21-23页 |
| 第二章 猕猴川西亚种肿瘤坏死因子α基因克隆和原核表达 | 第23-44页 |
| 1 试验材料 | 第23-26页 |
| 1.1 质粒以及菌株 | 第23-24页 |
| 1.2 酶和试剂 | 第24-25页 |
| 1.3 大肠杆菌培养基的配制 | 第25页 |
| 1.4 SDS-PAGE和WB所需试剂和材料 | 第25页 |
| 1.5 其他试剂的配制 | 第25-26页 |
| 1.6 主要仪器设备 | 第26页 |
| 2 试验方法 | 第26-34页 |
| 2.1 MmTNF-α基因的克隆与序列分析 | 第26-29页 |
| 2.1.1 猕猴川西亚种外周血淋巴细胞的分离 | 第26页 |
| 2.1.2 猕猴川西亚种外周血淋巴细胞总RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.1.3 引物的设计与合成 | 第27页 |
| 2.1.4 目的片段的扩增 | 第27页 |
| 2.1.5 目的片段的回收与纯化 | 第27-28页 |
| 2.1.6 感受态细胞的制备 | 第28-29页 |
| 2.1.7 目的片段的连接转化 | 第29页 |
| 2.1.8 阳性重组子的筛选与鉴定 | 第29页 |
| 2.2 MmTNF-α基因原核表达载体的构建与鉴定 | 第29-32页 |
| 2.2.1 表达引物的设计与合成 | 第29-30页 |
| 2.2.2 MmTNF-α原核表达载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.2.3 MmTNF-α原核表达载体的鉴定 | 第31-32页 |
| 2.3 确定重组表达菌的诱导表达 | 第32-33页 |
| 2.4 诱导表达条件的优化 | 第33页 |
| 2.4.1 IPTG浓度优化 | 第33页 |
| 2.4.2 温度条件优化 | 第33页 |
| 2.4.3 诱导时间优化 | 第33页 |
| 2.5 确定融合蛋白的表达方式 | 第33-34页 |
| 2.6 Western Blotting检测 | 第34页 |
| 3 结果与分析 | 第34-41页 |
| 3.1 MmTNF-α基因序列分析与同源性比较 | 第34-37页 |
| 3.1.1 序列分析 | 第34-35页 |
| 3.1.2 同源性比较 | 第35-37页 |
| 3.2 MmTNF-α原核表达重组质粒的鉴定 | 第37-38页 |
| 3.3 重组MmTNF-α的原核表达 | 第38-39页 |
| 3.3.1 IPTG浓度优化 | 第38-39页 |
| 3.3.2 温度条件优化 | 第39页 |
| 3.3.3 诱导时间优化 | 第39页 |
| 3.4 重组MmTNF-α原核表达产物的表达方式 | 第39-41页 |
| 3.5 Western Blotting检测结果 | 第41页 |
| 4 讨论 | 第41-42页 |
| 5 小结 | 第42-44页 |
| 第三章 猕猴川西亚种TNF-α真核表达载体的构建和表达 | 第44-62页 |
| 1 试验材料 | 第44-46页 |
| 1.1 质粒以及菌株 | 第44-45页 |
| 1.2 酶和试剂 | 第45页 |
| 1.3 毕赤酵母培养基的配制 | 第45-46页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第46页 |
| 2 试验方法 | 第46-51页 |
| 2.1 MmTNF-α基因酵母表达载体的构建 | 第46-47页 |
| 2.2 MmTNF-α真核表达载体的鉴定 | 第47页 |
| 2.3 MmTNF-α基因酵母表达载体的构建及鉴定 | 第47-51页 |
| 2.3.1 重组质粒pPIC9K-MmTNF-α线性化 | 第47-48页 |
| 2.3.2 毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第48页 |
| 2.3.3 质粒的电转化 | 第48页 |
| 2.3.4 PCR鉴定转化子 | 第48-49页 |
| 2.3.5 重组菌表型的筛选 | 第49-50页 |
| 2.3.6 重组酵母菌的诱导表达 | 第50-51页 |
| 3 结果与分析 | 第51-57页 |
| 3.1 MmTNF-α真核表达重组质粒的鉴定 | 第51-52页 |
| 3.2 质粒线性化结果 | 第52-53页 |
| 3.3 电转化结果 | 第53页 |
| 3.4 重组酵母菌阳性克隆的筛选 | 第53-55页 |
| 3.4.1 转化子PCR鉴定结果 | 第53-54页 |
| 3.4.2 转化子表型筛选结果 | 第54-55页 |
| 3.5 重组酵母菌MmTNF-α的表达分析 | 第55-56页 |
| 3.6 Western Blotting检测结果 | 第56页 |
| 3.7 从密码子偏爱角度分析MmTNF-α酵母中的表达情况结果 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-61页 |
| 4.1 表达系统的选择 | 第57-58页 |
| 4.2 毕赤酵母转化方法比较 | 第58-59页 |
| 4.3 转化子表型分析 | 第59-60页 |
| 4.4 重组酵母阳性克隆的筛选及表达 | 第60-61页 |
| 5 小结 | 第61-62页 |
| 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 附录 | 第70-71页 |
